歐仕穎，余長芳，余海霞，澤汪格瑪，楊建蓉

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染能夠引起獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，主要表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞功能缺陷[1-2]，嚴(yán)重威脅人類健康，但具體發(fā)病機(jī)制未明。免疫細(xì)胞表面的免疫調(diào)控受體在免疫細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其中程序性死亡分子1(programmed death 1，PD-1)和 T 細(xì)胞免疫球蛋白及免疫酪氨酸樣抑制基序(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)是起到負(fù)性調(diào)控作用的2種免疫調(diào)控受體，已經(jīng)被證實(shí)在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T細(xì)胞中呈高表達(dá)趨勢且與CD4+T細(xì)胞的數(shù)目呈負(fù)相關(guān)[3-4]，由此提示PD-1及TIGIT的高表達(dá)與HIV感染后CD4+T細(xì)胞功能的缺陷有關(guān)。CD4+T細(xì)胞包含了多種輔助性T細(xì)胞(T helper，Th)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T，Treg)亞群，CD4+T細(xì)胞總數(shù)發(fā)生變化的過程中，不同亞群也會出現(xiàn)不同的改變。為了進(jìn)一步明確PD-1、TIGIT 2種免疫調(diào)控受體在HIV感染進(jìn)程中所起到的作用，現(xiàn)分析HIV感染者外周血PD-1、TIGIT基因表達(dá)水平與T細(xì)胞分化、凋亡分子分泌的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年6月—2018年8月四川省甘孜藏族自治州人民醫(yī)院傳染病科診斷為HIV感染的患者80例作為HIV組，均符合中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會艾滋病學(xué)組制定的艾滋病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，經(jīng)免疫印跡法確診為HIV陽性，均為初次確診、未接受過抗病毒治療。HIV組男49例，女31例，年齡22～54(31.93±5.83)歲；病程9～34(17.38±3.23)月；合并糖尿病29例，高血壓17例，高脂血癥14例。另取同期在醫(yī)院體檢的健康者60例作為健康對照組，男34例，女26例，年齡21～55(32.15±6.24)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，全部受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)與方法 2組受試人員均清晨空腹采集肘靜脈血8～10 ml，-80℃置入冰箱備用。

1.2.1 PD-L1、TIGIT mRNA表達(dá)檢測： 取上述血液2～3 ml抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照cDNA 1 μl、UltraSYBR Mixture試劑10 μl、引物混合液0.8 μl、去離子水8.2 μl配置反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)后計(jì)算PD-L1、TIGIT的mRNA表達(dá)。試劑盒及UltraSYBR Mixture試劑購自北京康為世紀(jì)公司。

1.2.2 CD4+T細(xì)胞亞群檢測：取上述血液3～4 ml以EDTA抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)后用RPMI1640調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×106/ml，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)分裝細(xì)胞懸液100 μl。避光孵育PC5標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的IFN-γ抗體后以流式細(xì)胞儀(NovoCyte 1040，艾森生物公司產(chǎn)品)測定Th1細(xì)胞數(shù)目。避光孵育PC5標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的IL-4抗體后在流式細(xì)胞儀上測定Th2細(xì)胞數(shù)目。避光孵育PC5標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的IL-9抗體后在流式細(xì)胞儀上測定Th9細(xì)胞數(shù)目。避光孵育FITC標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的IL-17抗體后在流式細(xì)胞儀上測定Th17細(xì)胞的數(shù)目。避光孵育FITC標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的CD25抗體、PE-cy5標(biāo)記的Foxp3抗體后在流式細(xì)胞儀上測定Treg細(xì)胞的數(shù)目。

1.2.3 血清凋亡分子檢測： 取上述血液2 ml后離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、自殺相關(guān)蛋白因子(Fas)、Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TRAIL的含量，試劑盒購自上海西唐生物公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組PD-L1、TIGIT mRNA表達(dá)水平比較 與健康對照組比較，HIV組外周血中PD-L1、TIGIT的mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)，見表1。

表1 2組PD-L1、TIGIT mRNA表達(dá)水平比較

2.2 2組外周血CD4+T細(xì)胞亞群數(shù)目比較 與健康對照組比較，HIV組外周血Th1、Th17細(xì)胞數(shù)目明顯降低，Th2、Th9、Treg細(xì)胞數(shù)目明顯升高(P均<0.01)，見表2。

2.3 2組血清凋亡分子含量比較 與健康對照組比較，HIV組血清Bcl-2含量明顯降低，F(xiàn)as、FasL、TNF-α、TRAIL含量明顯升高(P均<0.01)，見表3。

2.4 相關(guān)性分析 HIV組外周血PD-L1及TIGIT的mRNA表達(dá)水平與外周血Th1、Th17細(xì)胞數(shù)目以及血清Bcl-2含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.623、-0.591、-0.657、-0.452、-0.524、-0.612，P均<0.05)，與外周血Th2、Th9、Treg細(xì)胞的數(shù)目以及血清FasL、Fas、TNF-α、TRAIL的含量呈正相關(guān)(r=0.475、0.563、0.608、0.498、0.632、0.574、0.538、0.475、0.551、0.561、0.494、0.601、0.526、0.583，P均<0.05)。

3 討 論

HIV感染后主要通過殺傷CD4+T細(xì)胞來引起免疫缺陷， 但其機(jī)制仍未完全明確。PD-1和TIGIT是在免疫細(xì)胞表面廣泛表達(dá)的2種免疫調(diào)控受體，主要對免疫細(xì)胞的分化成熟、增殖起到負(fù)性調(diào)控作用。PD-1的配體PD-L1是B7家族中的T細(xì)胞共抑制分子，PD-L1與PD-1結(jié)合后一方面能夠通過細(xì)胞內(nèi)的SHP-2的磷酸化來引起T細(xì)胞表面受體通路中的多種反應(yīng)發(fā)生去磷酸化，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的分化成熟；另一方面能夠直接啟動細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生凋亡[6-7]。TIGIT在與免疫酪氨酸樣抑制基序結(jié)合后能夠產(chǎn)生抑制性信號，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的分化成熟[8]。劉婷婷等[9]研究認(rèn)為，PD-1和TIGIT 2種分子在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T細(xì)胞中的表達(dá)明顯增多且與CD4+T細(xì)胞數(shù)目、HIV病毒載量有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV組外周血中PD-L1、TIGIT的mRNA表達(dá)水平均明顯高于健康對照組。這一結(jié)果表明HIV感染患者外周血中PD-L1及TIGIT的高表達(dá)不是僅僅存在于CD3+CD4-T細(xì)胞表面，而是存在于整體水平，結(jié)合2種分子的生物學(xué)特性以及HIV病程中CD4+T細(xì)胞功能的衰竭也能夠進(jìn)一步提示，PD-L1及TIGIT的高表達(dá)能夠影響HIV病程中CD4+T細(xì)胞的分化及其相應(yīng)亞群的功能。

CD4+T細(xì)胞包含了多種亞群，在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了不同的作用[10]。Th1和Th2細(xì)胞是最早發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，Th1主要分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答且能發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)體液免疫、變態(tài)反應(yīng)但容易造成病毒、腫瘤發(fā)生免疫逃逸[11-12]。Th17和Treg是新發(fā)現(xiàn)的一對CD4+T細(xì)胞亞群，前者主要分泌IL-17并且具有較強(qiáng)的促炎及刺激T細(xì)胞活化的作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力；后者具有免疫抑制活性，通過分泌TGF-β1等抑制性細(xì)胞因子以及細(xì)胞間接觸抑制的方式來對免疫應(yīng)答起到負(fù)性調(diào)控作用[13-14]；Th9是新發(fā)現(xiàn)的功能與Th2相近的CD4+T細(xì)胞亞群，其分泌的IL-9能夠通過與受體IL-9R結(jié)合來抑制免疫功能[15]。本研究對HIV感染患者外周血中CD4+T細(xì)胞亞群的分析發(fā)現(xiàn)，HIV組外周血中Th1、Th17細(xì)胞的數(shù)目明顯低于健康對照組，Th2、Th9、Treg細(xì)胞的數(shù)目明顯高于健康對照組。這一結(jié)果表明雖然HIV感染能夠直接攻擊和殺傷CD4+T細(xì)胞，使CD4+T細(xì)胞的總數(shù)降低，但不同CD4+T細(xì)胞亞群的變化仍存在差異，具有細(xì)胞免疫應(yīng)答活性的Th1及Th17亞群分化受阻，具有免疫抑制活性的Th2、Th9、Treg亞群分化反而增強(qiáng)，進(jìn)而有利于HIV脫離免疫應(yīng)答的監(jiān)視、不斷繁殖并加重其對免疫功能的破壞。進(jìn)一步分析外周血PD-L1及TIGIT表達(dá)與HIV感染患者CD4+T細(xì)胞亞群的關(guān)系可知，PD-L1、TIGIT的表達(dá)水平與Th1、Th17的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，與Th2、Th9、Treg的數(shù)量呈正相關(guān)。這一相關(guān)性的結(jié)果提示HIV感染患者外周血中高表達(dá)的PD-L1、TIGIT能夠影響CD4+T細(xì)胞亞群的分化，阻礙Th1、Th17的分化，促進(jìn)Th2、Th9、Treg的分化，進(jìn)而使HIV感染患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答發(fā)生缺陷。

免疫細(xì)胞表面的PD-1和TIGIT一方面能夠通過阻礙細(xì)胞的分化成熟來影響免疫功能，另一方面也能直接刺激細(xì)胞凋亡程序活化、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)凋亡的程序包括線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑。Bcl-2是在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮抗凋亡作用的分子，能夠減少線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放并阻礙由細(xì)胞色素C介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[16]；FasL/Fas、TRAIL/TNF-α是在死亡受體凋亡途徑中發(fā)揮促凋亡作用的分子，通過配體—受體的方式結(jié)合后能夠在細(xì)胞內(nèi)招募Caspase分子并促進(jìn)其發(fā)生級聯(lián)激活，最終引起細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。本研究對HIV感染患者血清中凋亡分子含量的分析發(fā)現(xiàn)，HIV組血清中Bcl-2含量明顯低于健康對照組，F(xiàn)asL、Fas、TNF-α、TRAIL含量明顯高于健康對照組。這一結(jié)果表明HIV感染能夠造成患者體內(nèi)的線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑發(fā)生過度激活，血清中抗凋亡分子的含量減少、促凋亡分子的含量增多。進(jìn)一步分析外周血PD-L1及TIGIT表達(dá)與HIV感染患者體內(nèi)凋亡分子分泌的關(guān)系可知，PD-L1、TIGIT表達(dá)水平與Bcl-2含量呈負(fù)相關(guān)，與FasL、Fas、TNF-α、TRAIL含量呈正相關(guān)。這一相關(guān)性的結(jié)果提示HIV感染患者外周血中高表達(dá)的PD-L1、TIGIT不僅能夠影響CD4+T細(xì)胞的分化過程，還能通過激活細(xì)胞凋亡來造成CD4+T細(xì)胞的耗竭。

表2 2組CD4+T細(xì)胞亞群數(shù)目比較

表3 2組間血清凋亡分子含量比較

綜上所述，HIV感染者外周血中PD-1、TIGIT表達(dá)明顯增多；高表達(dá)的PD-1、TIGIT一方面影響 CD4+T細(xì)胞亞群的分化，表現(xiàn)為阻礙Th1、Th17的分化，促進(jìn)Th2、Th9、Treg的分化；另一方面影響凋亡分子的分泌，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑和死亡受體途徑的凋亡。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

歐仕穎：負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、開展及論文撰寫;余長芳、楊建蓉：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集；余海霞：負(fù)責(zé)論文審核及修改；澤汪格瑪：負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分析