吳錚，李文錚，王長華，程姝娟， 柳景華

經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)是治療冠心病的有效手段，能夠改善患者的臨床癥狀，但部分患者于PCI術(shù)后血小板仍可聚集出現(xiàn)再栓塞，進而影響病情的遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)歸。氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林是PCI術(shù)后常規(guī)的抗血小板治療方式，能夠抑制血小板聚集、降低血栓形成的風(fēng)險[1]。盡管如此，仍有部分患者在PCI術(shù)后接受抗血小板藥物治療后繼續(xù)出現(xiàn)血小板聚集，嚴(yán)重者形成支架內(nèi)血栓。近年來關(guān)于抗血小板藥物的研究認(rèn)為，氯吡格雷進入體內(nèi)后不直接發(fā)揮抗血小板作用，而是需要通過CYP2C19基因編碼的細(xì)胞色素P450將該藥物代謝為有抗血小板活性的形式，進而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。在該過程中，CYP2C19基因的多態(tài)性直接影響了編碼產(chǎn)物的催化功能，進而導(dǎo)致氯吡格雷抗血小板效應(yīng)發(fā)生改變[2-3]。為了明確CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷抗血小板治療效果的影響，本研究具體分析了CYP2C19基因多態(tài)性與PCI術(shù)后患者氯吡格雷治療血小板功能、炎性反應(yīng)及病情轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1—4月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科接受PCI及術(shù)后氯吡格雷、阿司匹林抗血小板治療的冠心病患者204例作為研究對象，根據(jù)CYP2C19基因多態(tài)性分為野生型患者93例、雜合突變型患者57例、純合突變型患者54例。3型患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，全部患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合不穩(wěn)定型心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)自愿接受PCI手術(shù)；(3)術(shù)后給予氯吡格雷300 mg和阿司匹林300 mg負(fù)荷劑量治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有急性心肌梗死發(fā)作病史的患者；(2)PCI術(shù)前血小板計數(shù)異常的患者；(3)使用噻氯匹定、沙格雷酯等影響血小板功能的藥物；(4)存在應(yīng)用阿司匹林、氯吡格雷禁忌證的患者。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 CYP2C19基因多態(tài)性評價： PCI術(shù)前采集患者空腹肘靜脈血3 ml，采用基因組DNA提取試劑盒分離血液樣本中的基因組DNA，設(shè)計CYP2C19基因*2(rs4244285)的引物(上游引物5'-CATCTTTGATTCTCTTGT-3'，下游引物5'-CCAATCATTTAGCTTCAC-3')及*3(rs4986893)的引物(上游引物5'-TGAATCACAAATACGCAA-3'，下游引物5'-ATATTCATTTCCTGTGCA-3')，對基因組DNA進行PCR擴增后取PCR產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠內(nèi)進行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判斷CYP2C19基因多態(tài)性：CYP2C19*1/*1為野生型，CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3為雜合突變型，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3為純合突變型。

1.3.2 血小板功能指標(biāo)及炎性指標(biāo)檢測：PCI手術(shù)前采集患者肘靜脈血5 ml備用，檢測以下指標(biāo)。(1)血小板功能指標(biāo)，采用流式細(xì)胞法測定CD62P、CD63、PAC-1的水平，采用血栓彈力圖儀測定血栓形成速度(A)、最大振幅(MA)、凝血反應(yīng)時間(R)、血細(xì)胞凝集塊形成時間(K)。(2)炎性指標(biāo)，采用上海西唐公司的酶聯(lián)免疫吸附法測定C反應(yīng)蛋白(CRP)、CD40配體(CD40L)、可溶性細(xì)胞間黏附分子1(sICAM1)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)的含量，貨號分別為F00451、F00410、F01050、F01340。

表1 3型患者一般資料比較 [例(%)]

1.3.3 血小板聚集率及氯吡格雷抵抗評估： PCI術(shù)后給予患者阿司匹林300 mg和氯吡格雷300 mg負(fù)荷24 h，采集患者肘靜脈血3 ml，離心提取富血小板血漿、再離心提取貧血小板血漿，用貧血小板血漿調(diào)整富血小板血漿的血小板濃度至 200×109/L，采用血小板功能分析儀測定血小板聚集率后計算血小板抑制率；氯吡格雷治療后血小板聚集率下降不足10%定義為氯吡格雷抵抗。

1.3.4 觀測、記錄嚴(yán)重心臟事件： PCI術(shù)后對患者進行為期1年的隨訪，嚴(yán)重心臟事件為隨訪終點，嚴(yán)重心臟事件的定義為心血管病死亡、急性心肌梗死、支架內(nèi)血栓形成、預(yù)期外的支架植入術(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 3型患者血小板功能指標(biāo)比較 治療30 d后， CD62P、CD63、PAC-1、A、MA水平比較，純合突變型患者>雜合突變型>野生型患者，而R、K水平比較，純合突變型<雜合突變型<野生型患者(P<0.01)，見表2。

2.2 3型患者炎性指標(biāo)比較 治療30 d后，CRP、CD40L、sICAM1、IL-8水平比較，純合突變型>雜合突變型>野生型患者(P<0.01)，見表3。

2.3 3型患者病情轉(zhuǎn)歸比較 阿司匹林300 mg和氯吡格雷300 mg負(fù)荷24 h后，血小板抑制率比較，純合突變型<雜合突變型<野生型患者，而氯吡格雷抵抗率、嚴(yán)重心臟事件發(fā)生率(治療1年內(nèi))比較，純合突變型>雜合突變型>野生型患者(P均<0.05)，見表4。

3 討 論

阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治療是PCI術(shù)后重要的輔助治療方式，通過抑制血小板聚集來預(yù)防支架內(nèi)血栓形成、降低遠(yuǎn)期心血管事件的發(fā)生風(fēng)險。氯吡格雷的抗血小板活性通過阻礙血小板P2Y12受體下游信號通路的活化來發(fā)揮，該藥物本身是無活性的前體，在體內(nèi)通過P450氧化酶系統(tǒng)代謝后產(chǎn)生具有抗血小板活性的產(chǎn)物[4]；當(dāng)P450氧化酶系統(tǒng)的功能發(fā)生紊亂時，氯吡格雷的抗血小板活性會受到影響[5]。CYP2C19基因的編碼產(chǎn)物是P450氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，在氯吡格雷的代謝過程中起到關(guān)鍵作用[6]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因的*2等位基因及*3等位基因存在多態(tài)性，表現(xiàn)為等位基因的突變或缺失；*2等位基因的突變會影響轉(zhuǎn)錄蛋白的剪切活性，*3等位基因的突變會降低蛋白轉(zhuǎn)錄的活性[7-8]。CYP2C19*2和*3等位基因發(fā)生突變后，編碼產(chǎn)物活性的變化會直接影響氯吡格雷的抗血小板功能。

表2 3型患者血小板功能指標(biāo)比較

表3 3型患者炎性指標(biāo)比較

表4 3型患者病情轉(zhuǎn)歸比較

本研究在PCI術(shù)后使用阿司匹林300 mg和氯吡格雷300 mg負(fù)荷劑量進行抗血小板治療，通過分析血小板聚集率來評估血小板抑制率及氯吡格雷抵抗率，存在CYP2C19*2和*3等位基因突變患者的血小板抑制率低于未發(fā)生突變的野生型患者，氯吡格雷抵抗率則高于未發(fā)生突變的野生型患者，且發(fā)生純合突變患者血小板抑制率、氯吡格雷抵抗率的改變較雜合突變型更為明顯。這一結(jié)果提示CYP2C19*2和*3等位基因的突變會影響氯吡格雷的抗血小板活性，且純合突變的影響較雜合突變更為顯著，藥物的抗血小板活性受影響后會促進PCI術(shù)后發(fā)生血小板聚集，進而增加心血管事件的發(fā)生風(fēng)險。本研究進一步對PCI術(shù)后1年內(nèi)嚴(yán)重心臟事件的隨訪發(fā)現(xiàn)，CYP2C19 基因突變患者的嚴(yán)重心臟事件發(fā)生率高于野生型患者，且純合突變患者的嚴(yán)重心臟事件發(fā)生率高于雜合突變患者。這一隨訪結(jié)果與血小板抑制率的變化結(jié)果吻合，CYP2C19 基因突變后血小板抑制率降低并且遠(yuǎn)期嚴(yán)重心臟事件的發(fā)生率增高。

在血小板發(fā)生活化和聚集的過程中，血小板表面和血小板內(nèi)的多種信號分子發(fā)生激活[9-10]，而氯吡格雷通過拮抗血小板P2Y12受體下游信號通路能夠使相應(yīng)信號分子的激活受阻。CD62P和PAC-1是血小板表面的特異性標(biāo)志物，CD63是血小板內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在血小板的活化過程中起到關(guān)鍵作用[11-12]。本研究對上述血小板活化指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)，CYP2C19 基因突變患者的CD62P、CD63、PAC-1水平均明顯高于野生型患者，且純合突變患者的CD62P、CD63、PAC-1水平均明顯高于雜合突變患者。血小板在多種信號分子的作用下發(fā)生活化后，血栓形成能力增強，在血栓彈力圖中表現(xiàn)為R和K的縮短、A和MA的增大[13-14]。進一步通過分析血栓彈力圖參數(shù)來反映血小板功能，CYP2C19 基因突變患者的R和K水平均明顯低于野生型患者、A及MA水平明顯高于野生型患者，且純合突變患者的R和K水平均明顯低于雜合突變患者、A及MA水平明顯高于雜合突變患者。以上血小板活化指標(biāo)和血栓彈力圖參數(shù)的結(jié)果表明，CYP2C19 基因突變后血小板的聚集功能增強且純合突變對血小板聚集功能的增強作用高于雜合突變。

血小板活化過程不僅涉及自身信號分子的激活，還與體內(nèi)炎性反應(yīng)激活過程中炎性因子的作用有關(guān)， 炎性因子能夠促進血小板聚集形成血栓、增強血小板的活化狀態(tài)[15]。CRP是肝細(xì)胞合成的炎性標(biāo)志物，屬于急性時相蛋白，炎性反應(yīng)過程中促炎因子能夠刺激肝細(xì)胞內(nèi)CRP的合成，分泌進入血液循環(huán)的CRP能夠增強炎性反應(yīng)的程度；CD40L是炎性細(xì)胞表面受體CD40的配體，兩者結(jié)合后能夠促進炎性細(xì)胞的遷移、浸潤并參與炎性反應(yīng)的級聯(lián)激活[16]；sICAM1和IL-8分別是具有黏附活性和趨化活性的細(xì)胞因子，能夠促進炎性細(xì)胞的黏附、趨化運動，有利于炎性反應(yīng)的級聯(lián)放大[17-18]。本研究對上述炎性反應(yīng)指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)，CYP2C19 基因突變患者的CRP、CD40L、sICAM1、IL-8水平均明顯高于野生型患者，且純合突變患者的CRP、CD40L、sICAM1、IL-8水平均明顯高于雜合突變患者。這一結(jié)果表明CYP2C19 基因突變后炎性反應(yīng)的激活程度加劇，且純合突變對炎性反應(yīng)的激活作用強于雜合突變。

綜上所述，CYP2C19基因*2和*3等位基因突變能夠加重血小板抵抗、促進血小板聚集、激活炎性反應(yīng)。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

吳錚、程姝娟：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；李文錚：分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;王長華、柳景華：臨床信息采集，資料搜集整理，進行統(tǒng)計學(xué)分析