鄒 亮， 程 輝， 張 婷， 周 英， 關 軍， 程 平， 王蘭蘭

(武漢市第一醫(yī)院血液內科， 湖北 武漢 430022)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種B細胞來源的惡性腫瘤，發(fā)生率約占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%[1],其特征為骨髓中克隆性漿細胞異常增生，分泌單克隆免疫球蛋白或其片段，并導致相關器官或組織損傷；常見臨床表現為骨痛、貧血、腎功能不全和感染等[2]。目前，多種療法雖都能夠顯著延長患者的生存壽命，但MM仍然是一種不可治愈性疾病，該病致病機理相關研究顯示，骨髓微環(huán)境在MM的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。血管生成素1(angiogenin 1，Ang1)、Ang2及血管內皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)等是引起的微環(huán)境變化重要因子，其對骨髓瘤細胞的生長、生存、遷移、耐藥性、免疫逃逸以及MM患者的骨髓血管形成同樣起到相當重要的作用[3]。因此，研究微環(huán)境變化對骨髓瘤細胞生物學特性的改變對臨床治療MM意義重大。改變骨髓瘤細胞的生物學特性將是治療MM的最終目的，抑制其集落形成能力及內皮細胞血管生成是其中的重要方向。全基因組測序分析結果顯示，DIS3基因突變所獲得的腫瘤基因活性被認為可能是導致MM發(fā)生的原因之一[4]。但DIS3的表達調控能否影響骨髓瘤細胞的生物學特性，尤其是對自身惡性生物學特征的改變、微環(huán)境的調節(jié)等作用機制還不清楚。

本研究以3種人骨髓瘤細胞為研究對象，以DIS3表達調控為研究重點，通過對骨髓瘤細胞中DIS3基因進行過表達及干擾，探究由此所致的人骨髓瘤細胞集落形成能力及人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)體外管形結構生成能力的變化，旨在為臨床治療MM提供潛在靶點及可靠的理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要材料、試劑及儀器

人骨髓瘤細胞株NCI-H929、RPMI-8226和U266及HUVECs購自ATCC；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素及Lipofectamine 2000購自Invitrogen；真核表達載體pEGFP-N1由武漢華聯(lián)科生物技術有限公司分子實驗室保存并提供；細胞RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自TaKaRa；SYBR Green染料購自Lumiprobe Corporation；Matrigel基質膠購自BD Biosciences；細胞蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人Ang1、Ang2、VEGF-A、低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、HIF-3α和GAPDH抗體以及山羊抗兔II抗IgG購自Abcam；其它試劑均為上海國藥試劑分析純。3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；倒置顯微鏡(Nikon)；全自動化學發(fā)光分析儀(Tanon-5200)；凝膠處理分析系統(tǒng)(ABI)；實時熒光定量PCR儀(Bio-RAD)；低溫冷凍離心機(Eppendorf)；酶標儀(Bio-Tek)。

2 方法

2.1細胞的復蘇、培養(yǎng)及轉染 將人骨髓瘤細胞株NCI-H929、RPMI-8226和U266分別用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L的鏈霉素)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數期時進行DIS3過表達及siRNA干擾實驗。分別選取經預實驗驗證成功的過表達質粒pEGFP-N1-DIS3及DIS3-siRNA，根據Lipofectamine 2000轉染說明書操作分別對3種細胞進行轉染，轉染8 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后根據實驗要求選取各組細胞進行同步化培養(yǎng)操作，并在指定時點收集細胞進行相關檢測。

2.2平板集落形成實驗 取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組細胞分別以每皿50、100和200個細胞的梯度密度分別接種于含10 mL，37 ℃預溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周；經常觀察，當培養(yǎng)皿中出現肉眼可見的細胞集落時，終止培養(yǎng)，棄去上清液；用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞作用15 min；然后去固定液，加適量GIMSA染色液，作用10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥后倒置平皿并拍照記錄。實驗重復3次。

2.3RT-qPCR檢測mRNA的表達水平 根據NCBI上公布的各基因序列分別設計qPCR用引物。Ang1的上游引物序列為5’-CACCAACAACAGTGTCCT-3’，下游引物序列為5’-CTTCCTCTCTTTTTCCTCC-3’；Ang2的上游引物序列為5’-CTTTACTACGGCCTCTC-3’，下游引物序列為5’-TCACTGTCCATCAACTG-3’；VEGF-A的上游引物序列為5’-GGATCAAACCTCACCAA-3’，下游引物序列為5’-GCAGGAACATTTACACG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；各引物由上海生物工程有限公司代為合成。細胞培養(yǎng)48 h后提取RNA后反轉錄成cDNA，采用20 μL PCR反應體系：各基因對應上、下游引物各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌雙蒸水8 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 25 s，35個循環(huán)；65 ℃ 5 min、95 ℃ 50 s。以GAPDH為內參照。采用2-ΔΔCt法計算各基因的mRNA相對表達量。

2.4Western bolt檢測各指標的蛋白表達量 48 h后收集各組細胞，采用全蛋白提取試劑盒對3種細胞各組樣本分別進行蛋白提?。缓笥肂CA蛋白濃度檢測試劑盒對所提蛋白進行濃度檢測；緊接著取20 μg蛋白和4 μL 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100 ℃變性10 min；上樣，SDS-PAGE分離后轉至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入兔抗人 I 抗(Ang1，1∶800；Ang2，1∶1 000；VEGF-A，1∶500；HIF-1α，1∶500；HIF-3α，1∶500；GAPDH，1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標記的 II 抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學發(fā)光液進行顯色。以GAPDH為內參照，后采用Quantity One圖像分析軟件進行灰度比分析。

2.5Matrigel法檢測HUVECs體外的成管能力 各組骨髓瘤細胞同步化培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞培養(yǎng)上清液備用。用預冷的PBS將基質膠稀釋至4 g/L，并以每孔400 μL的量加入24孔板中；將24孔板置于37 ℃放置1 h以形成膠層；膠層形成后，每孔加入各組細胞培養(yǎng)上清液200 μL以及處于對數生長期的HUVECs懸液200 μL；置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；倒置顯微鏡觀察并拍照。以可清晰觀察到管腔樣結構代表內皮細胞具有成管能力。同時，每孔隨機選取3個不同視野，倒置顯微鏡計數由HUVECs圍成完整的毛細血管管腔樣結構的數量。

3 統(tǒng)計學處理

所有數據均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較選擇單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 3種人骨髓瘤細胞DIS3過表達及敲減的效果驗證

與空載體組比較，DIS3過表達組細胞DIS3蛋白表達水平顯著上升(P<0.01)；與siRNA-NC組比較，siRNA-DIS3組細胞DIS3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，3種細胞的變化趨勢基本一致，提示DIS3過表達或敲減成功,見圖1。

2 過表達或干擾DIS3對細胞集落形成能力的影響

與空載體組比較，DIS3過表達組細胞集落形成能力顯著下降(P<0.05)；與siRNA-NC組比較，siRNA-DIS3明顯促進了細胞的集落形成(P<0.05),且3種細胞的變化趨勢基本一致,見圖2。

3 過表達或干擾DIS3對骨髓瘤細胞HIF-1α和HIF-3α蛋白表達的影響

與空載體組比較，DIS3過表達顯著降低了HIF-1α和HIF-3α蛋白的表達水平(P<0.05)；而與siRNA-NC組比較，siRNA-DIS3顯著促進了HIF-1α和HIF-3α蛋白的表達水平(P<0.05)，且3種細胞的變化趨勢基本一致，見圖3。

4 過表達或干擾DIS3對骨髓瘤細胞Ang1、Ang2及VEGF-A mRNA水平的影響

與空載體組比較，DIS3過表達顯著降低了Ang1、Ang2及VEGF-A的mRNA水平(P<0.05)；而與siRNA-NC組比較，siRNA-DIS3顯著升高了Ang1、Ang2及VEGF-A的mRNA水平(P<0.01),且3種細胞的變化趨勢基本一致,見圖4。

5 過表達或干擾DIS3對骨髓瘤細胞Ang1、Ang2及VEGF-A蛋白表達水平的影響

與空載體組比較，DIS3過表達顯著降低了Ang1、Ang2及VEGF-A的蛋白水平(P<0.05)；而與siRNA-NC組比較，siRNA-DIS3顯著促進了Ang1、Ang2及VEGF-A的蛋白表達(P<0.05),且3種細胞的變化趨勢基本一致,見圖5。

Figure 1. Verification of DIS3 expression in 3 kinds of human myeloma cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsempty vector group;#P<0.05,##P<0.01vssiRNA-NC group.

圖1 3種人骨髓瘤細胞DIS3的表達

Figure 2. Plate colony formation assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsempty vector group;#P<0.05,##P<0.01vssiRNA-NC group.

圖2 平板集落形成實驗

6 過表達或干擾DIS3的骨髓瘤細胞對HUVECs體外管形結構形成的影響

與空載體組比較，DIS3過表達組骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液顯著抑制了HUVECs體外管形結構形成(P<0.01)；與siRNA-NC組比較，siRNA-DIS3組骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液顯著促進了HUVECs體外管形結構的形成(P<0.05),且3種細胞的變化趨勢基本一致,見圖6。

Figure 3. The effects of DIS3 on the protein expression of HIF-1α and HIF-3α in 3 kinds of human myeloma cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsempty vector group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

圖3 不同人骨髓瘤細胞中DIS3對HIF-1α及HIF-3α蛋白表達的影響

Figure 4. The effects of DIS3 on the mRNA expression of Ang1, Ang2 and VEGF-A in 3 kinds of human myeloma cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsempty vector group;##P<0.01vssiRNA-NC group.

圖4 不同人骨髓瘤細胞中DIS3對Ang1、Ang2及VEGF-A mRNA表達的影響

Figure 5. The effects of DIS3 expression levels on the protein expression of Ang1, Ang2 and VEGF-A in 3 kinds of human myeloma cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsempty vector group;#P<0.05,##P<0.01vssiRNA-NC group.

圖5 不同人骨髓瘤細胞中DIS3 對Ang1、Ang2及VEGF-A蛋白表達的影響

討 論

多發(fā)性骨髓瘤患者全基因組測序結果提示，DIS3基因突變所獲得的癌基因活性被認為可能是導致MM發(fā)生的原因之一；且其編碼蛋白DIS3是保守的RNA核酸酶及外泌體的催化亞基，能夠對所有的RNA進行加工或者促使其降解，對細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維護十分重要[5]。相關臨床研究發(fā)現，DIS3突變的MM患者總體中位生存期大大縮短，且與預后關系密切[6]。而在結直腸癌的相關研究中，DIS3因其異常高表達則被認為是結腸癌的新型候選腫瘤基因，且沉默DIS3會嚴重影響到結腸癌細胞的多個生物學特征，如遷移、侵襲以及增殖等[7]。因此，我們猜想DIS3基因突變導致的活性功能喪失是骨髓瘤細胞表現出惡性生物學特性的主要因素之一，也是促進MM進一步發(fā)展的誘因。通過對DIS3基因表達進行調控可能改變骨髓瘤細胞惡性生物學特性，例如改變癌細胞的集落形成能力、抑制內皮細胞血管生成等，進而阻礙MM腫瘤細胞無限發(fā)展的惡性循環(huán)。

Figure 6. The effects of DIS3 in human myeloma cells on the formation of tubular structuresinvitroof HUVECs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsempty vector group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

圖6 不同人骨髓瘤細胞中DIS3對HUVECs體外管形結構形成的影響

集落形成實驗從一定程度上反映了腫瘤細胞的群體依賴性及增殖能力。靶基因表達調控或藥物作用進而影響MM細胞集落形成能力的相關研究較為普遍，例如載紫杉醇的脂質微泡聯(lián)合超聲輻照體外作用于人多發(fā)性骨髓瘤U266細胞的研究顯示，不僅細胞的增殖能力受到抑制、凋亡水平增加，而且其細胞的集落形成能力明顯下降[8];慢病毒介導的Bmi-1基因沉默對骨髓瘤細胞生物學特性的影響研究發(fā)現，靶向干擾Bmi-1后可不僅抑制骨髓瘤細胞增殖及集落形成能力，更能有效增強骨髓瘤細胞對藥物硼替佐米的敏感性[9];在藥物地西他濱對多發(fā)性骨髓瘤U266細胞株生物學功能的影響研究中同樣發(fā)現，地西他濱呈濃度依賴性地抑制細胞的增殖能力，降低集落形成率[10]。而本研究發(fā)現，DIS3過表達能顯著抑制3種骨髓瘤細胞的集落形成能力，而敲減DIS3表達則顯著促進了其生長，提示對骨髓瘤細胞中DIS3基因表達進行調控能顯著改變細胞的集落形成能力，能從一定程度上改善骨髓瘤細胞的惡性增殖。

在MM發(fā)病機制的相關研究中發(fā)現，微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變扮演著重要角色，尤其是以VEGF為主要代表的多種生長因子與內皮細胞的相互作用導致骨髓血管生成是MM惡性發(fā)展的一大誘因[11]。因此，抑制骨髓血管生成對治療MM意義重大，改善MM細胞對內皮細胞的誘導作用是研究的重點之一。本研究結果顯示，DIS3過表達能通過抑制血管生成相關因子Ang1、Ang2和VEGF-A的表達及分泌水平進而削弱對內皮細胞的刺激作用，表現為內皮細胞產生一定的抗血管生成能力，提示對骨髓瘤細胞中DIS3基因進行表達調控能一定程度地抑制骨髓血管生成，為MM的抗血管生成治療提供了理論依據。在MM的臨床研究中發(fā)現，MM初發(fā)組、疾病進展組、復發(fā)組患者血清Ang2及VEGF水平顯著高于正常對照組，提示二者在MM的發(fā)生發(fā)展中可能存在潛在的協(xié)同作用[12]。且有研究表明VEGF反義RNA可以抑制骨髓瘤細胞增殖，促進其凋亡，并具有抗血管生成作用[13]。藥物黃芩素被發(fā)現能通過顯著抑制VEGF的表達而促進RPMI-8226細胞發(fā)生凋亡，且呈一定的劑量時間依賴性[14]。對MM臨床病理樣本的檢測發(fā)現，HIF-1α和VEGF的表達與MM的發(fā)生發(fā)展密切相關且兩者呈正相關，HIF-1α蛋白可能以轉錄激活的形式上調VEGF基因的表達，誘導血管生成，促進MM的發(fā)生發(fā)展，提示HIF-1α/VEGF信號通路是MM抗血管生成治療的關鍵[15]。缺氧可以激活參與腫瘤細胞代謝的眾多基因的表達，進而調控細胞存活、細胞增殖和細胞凋亡，HIF-3α是新發(fā)現的缺氧誘導因子家族的重要成員，其異常高表達被發(fā)現在人類結直腸癌的腫瘤樣本中，且與不良預后相關；過表達HIF-3α能通過激活JAK-STAT3信號進而促進結直腸癌細胞的增殖，提示抑制HIF-3α是治療結直腸癌的潛在靶點[16]。而在本實驗作用機制的相關研究中我們發(fā)現，MM相關的血管生成能力的抑制作用可能是由DIS3通過調控HIF-1α及HIF-3α的活化程度來實現的。

綜上所述，本研究結果證實對DIS3的表達進行調控可顯著改變人骨髓瘤細胞NCI-H929、RPMI-8226和U266的集落形成能力及內皮細胞管形結構的生成能力，其機制可能與調控HIF-1α及HIF-3α的活化程度而引發(fā)的MM細胞生物學特征改變有關。