許海濤， 王佳子

(1錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)2科， 遼寧 錦州 121001； 2 93263部隊場站醫(yī)院， 遼寧 錦州 121000)

心肌供血不足將導(dǎo)致心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，引起心肌梗死等心臟病理狀態(tài)。在臨床上，通常采用溶栓療法和皮冠狀動脈接入法等再灌注治療手段來快速恢復(fù)血液供應(yīng)、挽救瀕壞死心肌、改善心肌梗死預(yù)后等。然而，心肌血流的快速供應(yīng)將會加重心肌損傷，抑制心臟功能，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷。I/R引起的心肌細(xì)胞凋亡、心律失常、心肌頓抑等并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者的生命，大大削減了再灌注治療為患者帶來的收益。缺血預(yù)處理最初由Murry等[1]引入，可作為一種有效的內(nèi)源性心臟保護(hù)形式，通過降低缺血后心率失常嚴(yán)重程度和發(fā)生率，減少凋亡發(fā)生，從而促進(jìn)缺血后心肌功能的恢復(fù)[2-3]。和預(yù)處理效果類似，2003年Zhao等[4]提出在灌注開始時采用短暫的間歇重復(fù)性阻斷心肌供血，可顯著減輕I/R并提高機(jī)體對再灌注損傷的耐受力，顯著限制心肌梗死面積，改善冠狀動脈內(nèi)皮功能。研究表明，缺血后處理能夠有效的抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥反應(yīng)等[5-6]，然而關(guān)于其具體分子作用尚不清楚，因此，探討并揭示這些分子機(jī)制對于心肌梗死、急性心肌瀕死的臨床引用具有重要意義。

近年來發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA，miR)參與了心血管疾病中心率失常、心力衰竭、心肌肥厚以及心肌細(xì)胞凋亡等病理進(jìn)程，尤其在心肌梗死和心肌缺血等疾病中發(fā)揮重要作用[7-9]。據(jù)報道，miR-499在心臟部位高表達(dá)[10]，可調(diào)節(jié)線粒體平衡在心肌缺血中發(fā)揮重要作用[11]；上調(diào)其表達(dá)水平可顯著抑制凋亡并減少心肌梗死面積[12]。然而,關(guān)于miR-499與第10號染色體缺失的磷酸酶-張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究將構(gòu)建大鼠I/R模型以及心肌細(xì)胞損傷模型，探討miR-499和靶基因PTEN在心肌細(xì)胞損傷病理過程中的作用和分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

SD雄性大鼠購于武漢大學(xué)動物實驗中心，動物合格證編號為Y20180216，8周齡，體重220～260 g。胰酶、Ⅱ型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基和10%牛血清購自GIBCO；TRIzol和Lipofectamine?2000購自Invitrogen；SYBR? Premix Ex TaqTMII購自TaKaRa；基因組去除和反轉(zhuǎn)試劑盒購自Thermo；螢光素酶和BCA試劑盒購自碧云天；抗兔PTEN和GAPDH抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗購自CST；siR-PTEN、miR-499模擬物和抑制劑購自上海吉瑪。引物由上海生工合成。

2 實驗方法

2.1大鼠心肌I/R模型的構(gòu)建 設(shè)置實驗組和假手術(shù)組，對鼠齡相近的健康大鼠稱重，按照4 mL/kg量腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后除去空腔分泌物，氣管切開后連接插管，并連接呼吸機(jī)，調(diào)整頻率為60 min-1和潮氣量10～13 mL。左側(cè)胸消毒，第4肋間開胸，撕開心包，暴露心臟，6/0無損縫合線穿過心肌阻斷血管，判斷阻斷成功的標(biāo)志為心電圖ST段抬高、心肌蒼白。30 min后松開縫合線，使血管再通。

2.2大鼠原代心肌細(xì)胞的獲取 取健康大鼠使用75%乙醇浸泡數(shù)秒，在無菌條件下固定大鼠，暴露左胸，使用剪刀從第2肋間開胸，迅速取下心肌組織并浸入無菌預(yù)冷PBS中，剔除紅細(xì)胞和血管組織等，分出心室部位剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小的組織碎塊，加入Ⅱ型膠原酶混勻消化，加入DMEM終止消化，離心收集細(xì)胞，培養(yǎng)基重懸制備細(xì)胞單懸液，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至無菌瓶中，37 ℃靜置培養(yǎng)，待非心肌細(xì)胞沉降貼壁后吸取心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3細(xì)胞損傷模型的建立 取培養(yǎng)48 h的原代心肌細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入新鮮DMEM重懸細(xì)胞，并調(diào)整濃度為5×108/L，取2 mL至6孔板中，48 h后換培養(yǎng)基，加入終濃度為100 μmol/L的過氧化氫，2 h后測定細(xì)胞生物學(xué)特性。

2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 設(shè)置對照(control)組、miR-control組、miR-499組、anti-miR-control組和anti-miR-499組，使用Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)物質(zhì)至細(xì)胞，操作參考說明書。

2.5CCK-8法檢測細(xì)胞活力 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，接種100 μL于96孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，加入過氧化氫，培養(yǎng)6 h后加入10 μL CCK-8，避光孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度(A)值，每組3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

2.6乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放量的檢測 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L，接種100 μL于96孔板，37 ℃孵育2 h，收集各組細(xì)胞，LDH試劑盒檢測乳酸脫氫酶的釋放量，每組3個重復(fù)，結(jié)果取平均值，具體參考說明書。

2.7RT-qPCR實驗 提前準(zhǔn)備0.1% DEPC水去除實驗用品RNA酶，取出不同實驗組的細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS沖洗，使用TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。NanoDrop 2000測定A260/A280(1.8～2.0范圍內(nèi))，甲醛變性電泳檢測RNA完整性，DNA酶去除殘余基因組，試劑盒合成cDNA第1鏈。添加TB Green 10 μL、上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL、下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL和cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL至反應(yīng)體系中，設(shè)置程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s;40 cycles。以GAPDH為內(nèi)參照，每組3個重復(fù)，2-ΔΔCt法計算PTEN的mRNA表達(dá)水平。PTEN的上游引物為5’-CGACGGGAAGACAAGACAAGTT-3’，下游引物為5’-GCTAGCCTCTGGATTTGACG-3’；GAPDH的上游引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。以U6為內(nèi)參照，檢測miR-499的表達(dá)水平。miR-499的上游引物序列為5’-GGGGTTAAGACTTGCAGTG-3’，下游引物序列為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.8螢光素酶實驗 使用TargetScan查找miR-499和PTEN結(jié)合位點，設(shè)計合成PTEN的3’UTR-WT和3’UTR-Mut，使其連入ARE-GFP熒光報告質(zhì)粒中，分別與miR-499模擬物或miR-control共轉(zhuǎn)染，試劑盒檢測各組螢光素酶活性。

2.9Western blot實驗 收集miR-control組、miR-499組、anti-miR-control組和anti-miR-499組細(xì)胞，RIAP裂解，收集上清液，BCA測定蛋白濃度。取50 μg蛋白行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST洗1次。使用5%牛血清室溫封閉2 h，TBST洗2次，每次10 min，I 抗(1∶1 000)低溫過夜孵育，TBST洗2次，每次10 min，II 抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。DAB法顯色成像，進(jìn)行條帶灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 19.0分析處理數(shù)據(jù)。所得數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-499在I/R損傷模型中表達(dá)的變化

在I/R不同時點麻醉后摘取心臟，取左心室心尖組織檢測miR-499的表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果顯示，與大鼠假手術(shù)組(1.00±0.06)相比，I/R 6 h、12 h和24 h組miR-499相對表達(dá)水平分別為3.27±0.30、1.94±0.23和0.81±0.11?？梢姡诖笫笮募∪毖俟嘧p傷中，miR-499表達(dá)水平迅速提升，之后呈時間依賴性逐漸下降(F=95.649，P=0.000)，見圖1。

2 miR-499過表達(dá)對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

先以100 μmol/L的過氧化氫構(gòu)建心肌細(xì)胞損傷模型，后進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理， 將miR-499模擬物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞損傷模型中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-449模擬物后，miR-499顯著上調(diào)(P<0.01)。與control相比，I/R細(xì)胞損傷模型細(xì)胞存活率下降，LDH釋放量增加；上調(diào)miR-499顯著提升細(xì)胞模型的存活率，LDH表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The expression level of miR-499 in the myocardium of I/R injury model. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group.

圖1 miR-499在I/R損傷模型心肌組織中的表達(dá)水平

3 miR-499靶向調(diào)控PTEN

TargetScan分析發(fā)現(xiàn)PTEN mRNA的3’UTR含有miR-499種子序列保守堿基，螢光素酶實驗驗證兩者的靶向關(guān)系。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-control相比，miR-499和PTEN 3’UTR-WT報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，細(xì)胞螢光素酶相對活性明顯下降(P<0.05)，見圖3。

4 過表達(dá)miR-499抑制PTEN的表達(dá)

為探究miR-499對PTEN表達(dá)的影響，分別轉(zhuǎn)染miR-499模擬物和抑制劑至細(xì)胞，RT-qPCR和Wes-tern blot檢測PTEN表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-499表達(dá)促使PTEN mRNA和蛋白表達(dá)顯著減少，敲減miR-499表達(dá)促使PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖4。

5 siR-PTEN對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

將siR-PTEN轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力和LDH釋放的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siR-PTEN使胞內(nèi)PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)。下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)顯著提升細(xì)胞活力，促使LDH釋放量顯著減少(P<0.05)，即siR-PTEN能減輕心肌細(xì)胞損傷，見圖5。

6 miR-499靶向PTEN對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

為探究miR-499和PTEN在I/R中的作用機(jī)制，將anti-miR-499和siR-PTEN共轉(zhuǎn)染，檢測其在H2O2氧化應(yīng)激中作用效果。當(dāng)添加H2O2刺激心肌細(xì)胞后，與control相比，anti-miR-499組的細(xì)胞活力顯著下降，LDH生成量增加，細(xì)胞損傷加重；與anti-miR-499組相比，miR-499抑制劑和siR-PTEN共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力顯著得到提升，LDH釋放量顯著下降(P<0.05)，見圖6。

Figure 2. Effect of miR-499 on I/R injury model of the cardiomyocytes. A: the miR-499 transfection efficiency was determined by RT-qPCR; B: the cell viability was measured by CCK-8 assay; C: LDH release detection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmiR-control group;#P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsH2O2+miR-control group.

圖2 miR-499對細(xì)胞損傷模型的作用

Figure 3. Verification of the targeting relationship between miR-499 and PTEN. A: the target binding sites of miR-499 and PTEN; B: the results of luciferase assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-control group.

圖3 miR-499和PTEN的靶向關(guān)系驗證

討 論

miRNA是一類約為21 nt的小分子RNA，通過靶向調(diào)控靶mRNA參與機(jī)體生理病理過程[13-16]。近些年的研究表明，miRNA與心血管類疾病密切相關(guān)，目前miR-1、miR-24、miR-145、miR-26和miR-126等被認(rèn)為在心肌缺血發(fā)揮重要作用[17-18]。Agiannitopoulos等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-499的表達(dá)水平在心肌梗死中顯著上調(diào)，其表達(dá)水平可作為判斷心梗的分子標(biāo)志物；Qin等[20]對犬類進(jìn)行心肺移植時發(fā)現(xiàn)，犬左心室的miR-499在缺血再灌注后出現(xiàn)顯著下調(diào)；Zhu等[12]通過上調(diào)miR-499靶向抑制PDCD4因子的表達(dá)，能減輕再灌注損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死面積，從而改善左心室功能。在本研究中，我們檢測了大鼠I/R模型中miR-499的表達(dá)變化，結(jié)果與上訴報道一致，與假手術(shù)組相比，大鼠發(fā)生心肌缺血時miR-499表達(dá)水平迅速提高，又隨著損傷時間的延長逐漸下降。而后為探究miR-499在心肌細(xì)胞損傷中的作用，本研究將其模擬物轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞損傷模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-499能夠顯著提高細(xì)胞活力，降低LDH生成量減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。可見，miR-499對大鼠損傷的心肌具有保護(hù)作用。

Figure 4. The effect of miR-499 on PTEN expression. A: the mRNA expression level of PTEN was detected by RT-qPCR; B: the protein expression level of PTEN was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-control group;#P<0.05vsanti-miR-control group.

圖4 miR-499對PTEN表達(dá)的影響

Figure 5. Protective effect of siR-PTEN on the cardiomyocytes. A: the transfection efficiency of siR-PTEN detected by RT-qPCR; B: the transfection efficiency of siR-PTEN detected by Western blot; C: the cell viability measured by CCK-8 assay; D: the detection of LDH release. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiR-control group;#P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsH2O2+siR-control group.

圖5 siR-PTEN對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

Figure 6. The effect of co-transfection of miR-499 inhibitor (anti-miR-449) and siR-PTEN on the cardiomyocytes. A: the cell viability measured by CCK-8 assay; B: the LDH release levels. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsanti-miR-499 group.

圖6 miR-499抑制劑和siR-PTEN共轉(zhuǎn)染對心肌細(xì)胞的影響

使用TargetScan和miRcode對miR-499的靶基因進(jìn)行分析，進(jìn)而探索miR-499在大鼠I/R中的作用機(jī)制。以往研究表明，miR-499可靶向MEF2C[21]、PDCD4[22]和VAV3[23]等基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN是為miR-499的靶基因之一，增加miR-499表達(dá)量能夠顯著抑制PTEN表達(dá)，而敲減miR-499表達(dá)能夠促進(jìn)PTEN表達(dá)上調(diào)，螢光素酶實驗也證實兩者具有靶向關(guān)系。同時，Zu等[24]發(fā)現(xiàn)PTEN能夠促小鼠進(jìn)線粒體發(fā)生凋亡，加重I/R損傷；江夢等[25]發(fā)現(xiàn)PTEN下調(diào)可有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌梗死面積。為了探究PTEN的作用機(jī)制，本研究轉(zhuǎn)染siR-PTEN至大鼠心肌細(xì)胞損傷模型中，發(fā)現(xiàn)敲減PTEN表達(dá)能夠提高細(xì)胞活力，降低LDH生成量，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而緩解I/R損傷，與上述文獻(xiàn)一致。眾所周知，miRNA是通過結(jié)合靶基因mRNA 3’UTR抑制其翻譯過程或使發(fā)生降解，從而發(fā)揮對靶基因的負(fù)調(diào)控機(jī)制。為了探究miR-499靶向PTEN在心肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，本研究將miR-499抑制劑和siR-PTEN共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞損傷模型中，探究細(xì)胞存活率和氧化應(yīng)激反應(yīng)程度。結(jié)果顯示，與對照組相比，抑制劑組的細(xì)胞活力顯著下降，LDH生成量增加，細(xì)胞損傷加重；與anti-miR-499組相比，miR-499抑制劑和siR-PTEN共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力顯著得到提升，LDH釋放量顯著下降。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建大鼠I/R活體模型和大鼠心肌細(xì)胞損傷模型觀察miR-499表達(dá)的規(guī)律，并設(shè)計實驗證實了miR-499可通過靶向負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)而增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕大鼠心肌的病理損傷。