李雪蓮， 李智洋， 李賓公△， 柯 旋， 郝艷琴， 朱先杰

(1南昌大學第一附屬醫(yī)院心內科， 江西 南昌 330006； 2南京醫(yī)科大學, 江蘇 南京211116)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病(diabetic meuitus, DM)引起的以左室舒張功能受損和心功能不全為主要表現(xiàn)的心肌病變，其發(fā)病機制復雜，心肌代謝紊亂、氧化應激、神經體液激活、炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體損傷、血管腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活、糖基化產物的累積、心肌凋亡及自噬等都參與該病的病理生理過程[1-3]。目前，有研究指出炎癥小體(inflammasome)的激活與DCM發(fā)病密切相關[4]，可能是DCM治療的關鍵靶點。槲皮素(quercetin，QUE)廣泛存在于菟絲子和丹皮等多種中藥中，具有抗氧化、抗炎和清除自由基等作用。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以提高自噬水平，清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，抑制炎癥小體活化從而發(fā)揮其保護作用[5]。目前，槲皮素已被用于多種疾病的研究，但對于糖尿病心肌病的研究相對較少。本研究將探討槲皮素對 DCM炎癥小體激活的調控，從而為臨床防治 DCM提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 動物

健康成年雄性SD大鼠30只，體重200～220 g，由南昌大學實驗動物中心提供，許可證號為 SYXK(贛)2015-0001。

2 主要試劑與設備

2.1主要藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；槲皮素和鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma; 抗核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)抗體、抗含CARD的凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)抗體、抗casepase-1抗體和抗白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)購自Abcam; TUNEL試劑盒購自Roche；免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)購自北京索萊寶科技有限公司；Tween-20 和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天公司。

2.2儀器設備 石蠟包埋機(EG1160)、烘片機(H1220)、石蠟切片機 (RM-2235)和自動脫水機(TP1020)為LEICA產品；光學顯微鏡(BX-41， OLYMPUS)；彩色多普勒超聲儀(Sonos 7500， Phi-lips)；酶標儀(Thermo Multiskan)。

3 主要方法

3.1造模與分組 將SD大鼠隨機分為對照(control)組(10只)和模型組(30只)。動物適應性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，糖尿病模型組大鼠腹腔一次性注射 STZ(60 mg/kg)，正常對照組注射相同劑量的檸檬酸鹽緩沖液。每周檢測血糖，4周后以血糖≥16.6 mmol/L 選入糖尿病模型組，2只血糖不達標，剔除實驗，共28只選入模型組。糖尿病模型大鼠隨機分為DM組、DM+溶劑對照(DM+Veh)組和DM+槲皮素(DM+QUE)組，各9只。槲皮素組通過每日給予槲皮素灌胃(100 mg·kg-1·d-1)。普通飼料喂養(yǎng)16周，實驗過程中因并發(fā)癥或其它原因DM組死亡2只大鼠，DM+Veh組死亡1只。

3.2動物的一般情況采集 16 周末稱量各組大鼠體重(body weight，BW)并采用尾尖采血法檢測血糖。

3.3心功能檢測 應用10%水合氯醛 (3 mL/kg) 腹腔注射麻醉大鼠后行各組大鼠心臟功能檢測。通過多普勒超聲檢測心臟射血分數(shù)(ejection fraction，EF)、左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左室舒張早期最大血流/二尖瓣心房收縮期最大血流(E/A)和左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。

3.4ELISA法測定大鼠血清IL-1β和IL-18的含量 大鼠眼眶靜脈叢取血，存放于促凝管中，2 500 r/min，離心15 min后取血清。采用ELISA 測定血清中IL-1β和IL-18的水平，進行加樣、孵育、洗滌、顯色并終止反應，具體步驟按試劑盒說明書操作，終止后使用酶標儀在 450 nm 波長上讀出各孔吸光度(A)值，并根據(jù)試劑盒提供的標準品制作標準曲線，計算各組大鼠血清IL-1β和IL-18的含量。

3.5組織標本檢測 斷頸處死大鼠，取出心臟，將取材完畢后的心肌組織置入4%多聚甲醛溶液中固定，48 h 后進行脫水浸蠟、石蠟包埋并制作厚4.5 μm切片，光鏡下觀察蘇木素-伊紅(HE)染色心肌細胞形態(tài)及結構改變， Masson染色觀察心肌間質纖維化程度并分析膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction, CVF)。免疫組化檢測NLRP3和IL-1β表達評價心臟炎癥情況，TUNEL法觀察心肌細胞凋亡。

3.6Western blot測定大鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體蛋白的表達 大鼠新鮮心肌組織30 mg 左右，加入液氮研碎，每100 mg加入預冷的裂解緩沖液(RIPA∶PMSF=100∶1)1.0 mL 置于冰上放置 30 min，使其裂解充分；4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，吸取上清。并用 BCA 法測定蛋白濃度。蛋白提取定量后進行Western blot檢測，行10% SDS PAGE，轉移至 PVDF 膜上，封閉，依次加入 I 抗 [NLRP3(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)和IL-1β(1∶1 000)] 和II抗， ECL化學發(fā)光檢測。以β-actin(1∶2 000)為內參照。采用 ImageJ軟件處理圖像。

4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用 Satterthwaite校正后t檢驗。以P<0.05為有差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 槲皮素對大鼠一般情況的影響

對照組大鼠體重及飲食、飲水狀況正常，尿量正常，毛皮有光澤，反應靈敏；實驗組大鼠均出現(xiàn)不同程度的毛色枯黃、體形消瘦、煩躁、嗜睡等表現(xiàn)。16周后，實驗組大鼠較對照組體重明顯下降(P<0.05)，血糖明顯升高(P<0.05)；DM組與DM+Veh組的一般情況比較，差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)；與DM組相比，槲皮素組大鼠的體重和血糖的差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，見圖1，0。

Figure 1. The changes of general situation of the rats in each group. Mean±SD.n=7.*P<0.05vscontrol group.

圖1 各組大鼠一般情況的變化

2 槲皮素對大鼠心臟功能的影響

與對照組比較，DM組和DM+Veh 組的LVEDD明顯升高，E/A、EF和 FS 明顯下降(P<0.05)；槲皮素組較 DM和DM+Veh組的LVEDD、E/A、EF和FS均明顯改善(P<0.05)；DM組與DM+vehicle比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，見圖2，表明槲皮素明顯改善了糖尿病大鼠的心臟功能。

Figure 2. Comparison of echocardiographic findings in each group. Mean±SD.n=7.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDM group;&P<0.05vsDM+Veh group.

圖2 各組大鼠心臟彩超結果的比較

3 槲皮素對心肌纖維化的影響

3.1HE 染色觀察 HE染色觀測各組大鼠心肌大體形態(tài)，對照組的心肌纖維走行正常，心肌細胞排列整齊、核居細胞中央, 呈完整的圓形或橢圓形，染色均勻，未見肌纖維溶解；DM組走行紊亂，可見壞死、斷裂的心肌纖維，同時可見炎細胞浸潤、纖維細胞增生；槲皮素治療組與糖尿病心肌病組相比，心肌纖維壞死程度減輕，細胞形態(tài)大體完整，纖維細胞增生程度不明顯，見圖3A。

3.2Masson 染色觀察 對照組大鼠無明顯膠原纖維沉積；DM組心肌間質內有明顯藍染增粗的膠原纖維沉積，心肌纖維粗大，排列紊亂，心肌間質及血管周圍膠原纖維表達明顯增加；與DM組相比，槲皮素治療組心肌組織纖維化程度明顯降低，藍染增粗的膠原纖維明顯減少，見圖3B。與對照組大鼠相較，模型組大鼠心肌組織膠原量明顯增加，槲皮素處理后心肌組織膠原含量下降，模型組與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，見圖3C。

Figure 3. The representative images of HE staining (A) and Masson staining (B), and comparison of the collagen volume fraction (CVF) in the rats in each group (C). The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=7.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDM group;&P<0.05vsDM+Veh group.

圖3 各組大鼠HE染色和Masson染色結果及CVF分析

4 槲皮素對心肌細胞凋亡的影響

TUNEL觀察心肌細胞凋亡情況可見對照組心肌凋亡細胞較少，與對照組比較，DM組和DM+Veh組的心肌凋亡細胞明顯增多；與DM組比較，槲皮素組的心肌凋亡細胞明顯減少，見圖4A。 DM組和DM+Veh組凋亡細胞比例較control組明顯增加(P<0.05)，DM+QUE組凋亡細胞比例較DM和DM+Veh組明顯下降(P<0.05)，見圖4B。上述結果表明槲皮素能明顯改善糖尿病大鼠心肌細胞凋亡。

5 各組大鼠心肌組織免疫組織化學染色的觀察

對照組大鼠心臟組織正常沒有顏色變化，與對照組比較， DM組大鼠心肌胞質中呈現(xiàn)明顯棕黃色區(qū)域，說明心肌組織中NLRP3和IL-1β陽性表達強度顯著增加，與DM組比較，槲皮素組大鼠心肌組織中NLRP3和IL-1β表達水平明顯降低，見圖5。

Figure 4. The representative images and the quantitative analysis of TUNEL staining in each group. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=7.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDM group;&P<0.05vsDM+Veh group.

圖4 各組大鼠TUNEL染色結果

Figure 5. The representative images of immunohistochemical staining for NLRP3 and IL-1β in each group. The scale bar=50 μm.

圖5 各組大鼠心肌組織免疫組化結果

6 各組大鼠血清促炎因子的ELASA檢測結果

與對照組大鼠相比DM 組大鼠血清IL-1β和IL-18水平明顯上升，槲皮素治療組大鼠血清IL-1β和IL-18水平較DM組明顯下降(P<0.05)，見圖6。

Figure 6. The serum levels of IL-1β and IL-18 after STZ injection in different groups of rats measured by ELISA. Mean±SD.n=7.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDM group;&P<0.05vsDM+Veh group.

圖6 各組大鼠血清IL-1β和IL-18含量的變化

7 Western blot檢測各組大鼠心肌中NLRP3炎癥小體蛋白的表達量

與對照組比較， DM 組大鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體蛋白(NLRP3、ASC和caspase-1)及IL-1β表達量明顯升高; 槲皮素組大鼠心肌中NLRP3炎癥小體蛋白(NLRP3、ASC和caspase-1)及IL-1β的表達量明顯低于DM組(P<0.05)，見圖7。

Figure 7. The protein expression of NLRP3, caspase-1 (Casp-1), ASC and IL-1β in each group was determined by Western blot. Mean±SD.n=7.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDM group;&P<0.05vsDM+Veh group.

圖7 各組大鼠心臟中NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達水平的比較

討 論

DCM 的發(fā)病機制非常復雜，涉及多種反應，近年來，越來越多的研究表明炎癥在其中發(fā)揮著重要作用，長期炎癥環(huán)境下可使組織及細胞損傷，誘導其死亡。炎癥小體是一類分布于細胞胞漿中的蛋白復合體，可以感受細胞內多種與免疫及死亡相關的信號刺激，參與細胞功能調控，它作為炎癥活化的一種重要形式，在炎癥治病過程中起著重要作用[6-7]。NLRP3炎癥小體是其中研究最多的炎癥小體，由NLRP3、ASC和caspase-1組成。一旦NLRP3激活，將與ASC相結合，進一步募集pro-caspase-1并誘導pro-caspase-1進行自我剪切生成活化的caspase-1[8]?；罨腸aspase-1將前體形式pro-IL-1β剪切成具有活性的IL-1β，從而激活下游的炎癥反應，引起廣泛組織損傷及細胞死亡。炎癥細胞因子在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵的推動作用，伴隨著炎癥小體激活、細胞凋亡和膠原含量顯著增加[4, 9]。因此調控心肌炎癥小體活化是治療糖尿病心肌病的重要目標。我們的研究也證實糖尿病鼠心肌組織NLRP3小體蛋白表達明顯增加，IL-1β和IL-18炎癥因子活化水平明顯增多，凋亡細胞增加，心肌細胞發(fā)生明顯纖維化，提示NLRP3炎癥小體參與了糖尿病發(fā)心肌病的發(fā)病過程。

槲皮素可增加被高糖抑制的神經細胞的增殖活性，減少氧化應激損傷[10]。在STZ誘導的1型糖尿病中，槲皮素發(fā)揮了重要的抗氧化和抗炎作用，從而減少損傷[11-12]。槲皮素在體內外模型中可以通過清除ROS而抑制炎癥小體活化[13]。近年來因其顯著的抗炎功效被用于研究心血管疾病領域。此次研究結果顯示，槲皮素治療明顯減輕了DM組的心肌纖維化及心肌凋亡。DM組心肌中炎癥小體激活，炎癥因子水平升高；槲皮素治療組大鼠心肌中炎癥小體激活受抑制，炎癥因子水平降低。超聲檢測發(fā)現(xiàn)，槲皮素在一定程度上改善了糖尿病心肌病大鼠的心功能。這些結果說明槲皮素可通過抑制炎癥而減輕高糖誘導的心肌細胞損傷及心肌間質纖維化病變。

綜上所述，槲皮素能有效減輕糖尿病小鼠中高糖誘導的心肌細胞損傷，其作用機制與抑制炎癥小體活化、減少細胞凋亡及心肌間質纖維化有關，為糖尿病心肌病的治療提供了新的思路，其更多運用及機制有待進一步研究。