李 鴿，劉 肖，李青梅，楊艷艷，王彥紅，張改平,,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 3.江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

流感病毒(Influenza virus，IV)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒屬(Influenzavirus)，分為A(甲)、B(乙)、C(丙)3個(gè)型[1-3]，其中A型流感病毒由8個(gè)單股負(fù)鏈RNA(viralRNA，vRNA)片段組成，長(zhǎng)度為2 341～2 890個(gè)核苷酸[4-6]。豬流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的豬的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病，臨床以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭等為特征，發(fā)病率高，但死亡率低，此外還能引起懷孕母豬的流產(chǎn)[7]。目前，全球豬群中流行的流感病毒血清型以H1N1、H3N2和H1N2亞型為主，但各地流行的豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)譜系或基因節(jié)段的來(lái)源均有差異[8]。

流感病毒的抗原變異頻繁，通過(guò)不斷改變其抗原性，流感病毒可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[9]。根據(jù)抗原性變異的程度可以分為抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變。其中，由點(diǎn)突變?cè)斐傻目乖瓶蓪?dǎo)致流感每年的季節(jié)性流行，而由基因重組造成的抗原轉(zhuǎn)變則可能產(chǎn)生新的流感大流行[10]。因此，有人提出了廣譜流感抗體的概念。由于單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[11]，已被廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)診斷中。為此，本研究利用H1N1和H3N2病毒感染犬腎MDCK細(xì)胞，建立免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)單克隆抗體檢測(cè)方法，篩選具有保守性的SIV單克隆抗體，為豬流感的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試動(dòng)物、細(xì)胞系和毒株

SPF級(jí)雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，SPF級(jí)6～8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司，H1N1亞型(A/swine/Zhucheng/90/2014)和H3N2亞型(A/swine/Henan/1/2010)SIV分別由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和河南農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)，犬腎MDCK細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)和豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT和PEG 1500均購(gòu)自Sigma公司，羊抗鼠酶標(biāo)二抗購(gòu)自Jackson公司，鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購(gòu)自Proteintech Group公司，DMEM培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，PBST溶液由含0.05% Tween-20的PBS配制而成。

1.3 H1N1和H3N2亞型SIV的增殖和純化

分別將H1N1和H3N2亞型SIV用無(wú)菌的PBS進(jìn)行1∶1 000倍稀釋，取0.1 mL接種于9～11日齡SPF雞胚尿囊腔，于37 ℃培養(yǎng)72 h后測(cè)定H1N1和H3N2亞型SIV的血凝效價(jià)，之后無(wú)菌收取尿囊液，同時(shí)應(yīng)用Reed-Muench方法測(cè)定病毒尿囊液對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

將收集到的病毒尿囊液用0.1%甲醛滅活，采取差速離心法純化，對(duì)純化后的病毒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，分裝后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動(dòng)物免疫

隨機(jī)選取5只6周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量為50 μg/只。首次免疫將H1N1純化病毒與等量的弗氏完全佐劑乳化混勻后，進(jìn)行頸背部皮下多點(diǎn)注射。間隔14～21 d后，進(jìn)行二免時(shí)將H3N2純化病毒和等量的弗氏不完全佐劑乳化混勻后進(jìn)行注射。間隔14～21 d后，進(jìn)行三免時(shí)將H1N1純化病毒與等量的弗氏不完全佐劑乳化混勻后進(jìn)行注射，四免同二免。在融合前的3～5 d，對(duì)小鼠進(jìn)行尾部采血，并用IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法檢測(cè)血清效價(jià)，選取效價(jià)最高的小鼠，直接腹腔注射100 μg的H3N2純化病毒進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.5 IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法的建立

為篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，利用H1N1和H3N2亞型SIV感染MDCK細(xì)胞，建立IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)MDCK細(xì)胞至融合度達(dá)到80%時(shí)，分別接種倍比稀釋的H1N1和H3N2亞型SIV，并進(jìn)行12、24、36、48、60、72 h的感染，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入無(wú)水乙醇室溫固定15 min；使用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉1 h；將待檢雜交瘤細(xì)胞上清分別加入H1N1和H3N2亞型SIV感染孔中，于37 ℃反應(yīng)30 min；每孔加入50 μL倍比稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，于37 ℃反應(yīng)30 min；上述每步均用PBST充分洗滌；每孔加入50 μL AEC顯色液室溫顯色10～15 min，在顯微鏡下觀察顯色情況。

1.6 細(xì)胞融合和陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

無(wú)菌取免疫小鼠的脾細(xì)胞，然后與SP2/0細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行融合，用1.5中建立的IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，采用有限稀釋法對(duì)篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行3次亞克隆，最后獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株，收集單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)上清用于鑒定，將細(xì)胞凍于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 腹水的采集

隨機(jī)選取11～13周齡的雌性BALB/c小鼠，以0.5 mL/只的劑量對(duì)小鼠腹腔注射無(wú)菌液體石蠟，并在7 d后再次每只小鼠腹腔注射0.5 mL/只處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞(1×106個(gè)/mL)。注射后注意觀察小鼠的狀態(tài)，并于7 d后待小鼠腹部明顯脹大時(shí)，無(wú)菌進(jìn)行腹水采集，于3 000 r/min離心15 min以去除細(xì)胞與雜質(zhì)，收集上清并于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 單克隆抗體的鑒定

1.8.1 抗體效價(jià)的測(cè)定 采用1.5中建立的IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和抗體誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水效價(jià)，并將它們均從1∶10起進(jìn)行倍比稀釋至1∶1012。

1.8.2 抗體亞型的鑒定 用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)收集的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行單克隆抗體的亞型鑒定，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.8.3 抗體病毒反應(yīng)譜的測(cè)定 分別用H1N1和H3N2亞型SIV感染MDCK細(xì)胞，利用1.5中建立的IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法檢測(cè)單克隆抗體與病毒的反應(yīng)性，并同時(shí)檢測(cè)單克隆抗體與H5N1、H7N9和H9N2亞型流感病毒滅活細(xì)胞板(由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)的反應(yīng)性。

1.8.4 抗體特異性的鑒定 分別用豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒感染PK-15細(xì)胞，單克隆抗體培養(yǎng)上清作一抗，用IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法測(cè)定是否反應(yīng)。

1.8.5 抗體中和活性的鑒定 分別以不同稀釋度的3株單克隆抗體誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠腹水處理適當(dāng)稀釋的H1N1和H3N2亞型SIV毒株，接種至MDCK細(xì)胞，利用已知的H1N1或H3N2亞型SIV陽(yáng)性血清以IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法測(cè)定病毒對(duì)細(xì)胞的感染情況，評(píng)估3株單克隆抗體分別對(duì)H1N1和H3N2亞型SIV的中和活性。

1.8.6 抗體血凝抑制(HI)效價(jià)的鑒定 在96孔微量板的第1列加入單克隆抗體誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠腹水，倍比稀釋至第10列，第11列為已知的H1N1或H3N2亞型SIV陽(yáng)性血清，第12列為陰性對(duì)照；加入4個(gè)血凝單位病毒稀釋液，50 μL/孔，混勻、室溫靜置15～30 min；每孔加入50 μL的0.5%雞紅細(xì)胞，室溫靜置30 min后觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.8.7 Western blot檢測(cè) 將滅活的H1N1和H3N2亞型SIV的全病毒和SDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸10 min，每孔上樣20 μL，利用10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，以單抗上清為一抗，山羊抗鼠酶標(biāo)二抗 1∶10 000稀釋進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 H1N1和H3N2亞型SIV的純化

用SPF級(jí)雞胚培養(yǎng)H1N1和H3N2亞型SIV，收集的尿囊液經(jīng)差速離心后，獲得初步純化的病毒，其蛋白質(zhì)含量分別為8.6 mg/mL和9.8 mg/mL，血凝效價(jià)分別為2-8和2-9，TCID50分別為1×10-6.5/0.1 mL和1×10-6.8/0.1 mL。

2.2 IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法的建立

待MDCK細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，分別接種H1N1和H3N2亞型SIV，確定IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法的最佳接毒量為1 000個(gè)TCID50，接毒后的最佳培養(yǎng)時(shí)間為24 h，二抗的最佳稀釋度為1∶500，由圖1可知，MDCK細(xì)胞的胞漿被染成紅色，感染細(xì)胞比例合適，空白對(duì)照干凈無(wú)顯色，顯微鏡下的觀察結(jié)果更直觀。

A：小鼠陽(yáng)性血清；B：小鼠陰性血清

2.3 免疫小鼠血清效價(jià)的測(cè)定

由表1可知，用建立的IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法檢測(cè)5只小鼠的血清效價(jià)，血清效價(jià)在1.28×10-4～2.56×10-5，取效價(jià)最高的3號(hào)小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。

2.4 雜交瘤細(xì)胞的篩選

采用有限稀釋法對(duì)融合后篩選獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行3次連續(xù)亞克隆，最后獲得能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株16D5、18G8和20C4，經(jīng)IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，3株雜交瘤細(xì)胞上清均能在H1N1和H3N2亞型SIV感染的MDCK細(xì)胞中檢測(cè)到SIV并發(fā)生特異性結(jié)合，在顯微鏡下觀察到清晰的紅色斑點(diǎn)，而1640培養(yǎng)基則不能與H1N1和H3N2亞型SIV感染的MDCK細(xì)胞反應(yīng)，顯微鏡下未出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。

表1 免疫小鼠血清的IPMA效價(jià)Tab.1 IPMA titers of immunized mice serum

A: 雜交瘤細(xì)胞16D5的IPMA；B: 雜交瘤細(xì)胞18G8的IPMA；C: 雜交瘤細(xì)胞20C4的IPMA；D: 1640培養(yǎng)基的IPMA

2.5 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定和亞型的鑒定

如表2所示，3株單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)在1×10-4～1×10-3，抗體誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水的效價(jià)在1×10-6～1×10-5；亞型鑒定結(jié)果顯示，3株單克隆抗體的重鏈均為IgG1亞型，輕鏈為κ鏈。

2.6 單克隆抗體病毒反應(yīng)譜的測(cè)定

如圖3所示，用IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法測(cè)定3株單克隆抗體與H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亞型流感病毒的反應(yīng)性，結(jié)果表明，3株單克隆抗體均能在H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亞型流感病毒感染的MDCK細(xì)胞中檢測(cè)到流感病毒并發(fā)生特異性結(jié)合，在顯微鏡下可觀察到紅色斑點(diǎn)。

表2 單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)上清、抗體誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水效價(jià)和亞型鑒定Tab.2 Titers of monoclonal antibody cell culture supernatant, antibody-induced ascites produced by mice and subtype identification

A：H1N1亞型流感病毒感染的MDCK細(xì)胞；B：H3N2亞型流感病毒感染的MDCK細(xì)胞；C：H5N1亞型流感病毒感染的MDCK細(xì)胞；

2.7 單克隆抗體特異性、中和活性和HI活性的測(cè)定

單克隆抗體特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株單克隆抗體只與流感病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒反應(yīng)，說(shuō)明3株抗體均具有較好的特異性；中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株單克隆抗體均不能抑制H1N1和H3N2亞型SIV對(duì)MDCK細(xì)胞的感染，不具有病毒中和活性；HI試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株單克隆抗體對(duì)H1N1和H3N2亞型SIV均無(wú)HI活性(表3)。

表3 單克隆抗體中和活性和HI活性鑒定Tab.3 Identification of neutralizing activity and HI activity of monoclonal antibodies

2.8 單克隆抗體Western blot檢測(cè)

如圖4所示，制備的3株單克隆抗體均在約56 ku處出現(xiàn)一條特異性的條帶，且條帶單一，而空載泳道未出現(xiàn)條帶，說(shuō)明16D5、18G8和20C4這3株單克隆抗體針對(duì)的是NP蛋白。

M：蛋白質(zhì)預(yù)染Marker；1：?jiǎn)慰寺】贵w16D5與H1N1亞型SIV全

3 結(jié)論與討論

流感病毒NP蛋白非常保守，具有型的特異性，NP蛋白在同型病毒間的氨基酸同源性高于90%[12]，因此，NP蛋白是流感病毒分型的主要依據(jù)之一，也是動(dòng)物模型中研究最早的具有交叉保護(hù)效果的抗原。NP蛋白通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體生成殺傷性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[13]，且在A型流感病毒的不同亞型之間具有很高的交叉反應(yīng)活性[14]。ALTSTEIN等[15]用表達(dá)NP蛋白(H1N1亞型流感病毒)的痘病毒免疫小鼠，不僅能夠抵御人流感病毒H3N2的攻擊，還能有效抵御禽流感病毒H5N2的攻擊。研究人員用大腸桿菌表達(dá)的H3N2亞型流感病毒的NP蛋白免疫也可以達(dá)到交叉保護(hù)的效果，用H1N1亞型流感病毒攻毒后有78%的存活率[16]。由于流感病毒的多宿主和高度變異性，制備NP蛋白高度保守和交叉保護(hù)的廣譜流感抗體已成為一種新趨勢(shì)。

不同來(lái)源的免疫抗原對(duì)NP蛋白結(jié)構(gòu)有不同程度的影響，原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)不能進(jìn)行翻譯后加工，如糖基化修飾及二硫鍵形成等，可能導(dǎo)致重組表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)與天然結(jié)構(gòu)不符[17]。在真核系統(tǒng)表達(dá)中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染受很多因素影響，有可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題；同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)無(wú)法保證不同批次試驗(yàn)的均一性及穩(wěn)定性。因此，本研究采用純化的H1N1和H3N2亞型SIV交叉免疫小鼠，通過(guò)建立的IPMA單克隆抗體檢測(cè)方法篩選獲得3株單克隆抗體，通過(guò)Western blot分析均在56 ku附近出現(xiàn)一條特異性的條帶，且不具有中和活性和HI活性，說(shuō)明3株抗體均針對(duì)NP蛋白，3株抗體不僅效價(jià)高、特異性好，且具有良好的保守性和穩(wěn)定性，為流感病毒的監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)手段。