張 浩，王宏博，馬 武，賈聰俊，馬曉明，吳曉云，褚 敏，閻 萍，成述儒，梁春年

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

Hesx1(Homeobox expressed in ES cells)基因作為一種同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與胚胎的早期發(fā)育，直接影響前腦和垂體的發(fā)育。垂體在調(diào)控垂體前葉分泌生長激素(Growth hormone，GH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)、卵泡雌激素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(Luteotropic hormone，LH)等激素的過程中起到至關(guān)重要的作用，其中GH的分泌能夠直接影響動物的生長性狀，ACTH、FSH、LH的分泌也能夠產(chǎn)生潛在影響，因此，Hesx1基因在動物的生長發(fā)育中具有重要的地位。Hesx1基因是由澳大利亞生物學(xué)家THOMAS通過探針篩選在小鼠的ES細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，它含有氨基末端區(qū)域(Engrailed homology domain)和成對同源區(qū)域(Paired-like homeodomain)2個阻遏結(jié)構(gòu)域，其中氨基末端區(qū)域能夠衍生1個輔助阻遏物(Tlel)。在小鼠胚胎的早期發(fā)育過程中，Hesx1基因在前內(nèi)臟內(nèi)胚層(AVE)、前軸中胚層(AME)以及前神經(jīng)外胚層(ANE)中均有表達(dá)；在小鼠胚胎發(fā)育中期9.5～12.5 d時，Tlel與Hesx1基因共同在小鼠顱頰囊(垂體前葉基礎(chǔ))中表達(dá)，但在12.5 d后表達(dá)量開始快速減少，而PROP1基因以及其他調(diào)控垂體前葉細(xì)胞的基因開始表達(dá)[1]。也有研究表明，在哺乳動物中首次發(fā)現(xiàn)了Hesx1基因的2個轉(zhuǎn)錄本序列編碼一段相同的開放閱讀框，同時在同源結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有2個內(nèi)含子[2]；非洲蟾Hesx1與xANF-1基因具有高度的同源性(80%)，說明Hesx1與xANF-1基因?qū)儆谕环N同源結(jié)構(gòu)域類型[3]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，Hesx1基因的突變會引起某些疾病的發(fā)生，如視覺發(fā)育不全(SOD)、聯(lián)合垂體激素缺乏癥(CPHD)等。SOD是由于突變的Hesx1基因C末端影響前腦發(fā)育，從而導(dǎo)致視神經(jīng)和透明隔發(fā)育不完全，患病者主要表現(xiàn)為眼震、色盲、視覺異常、視敏度低、兩眼間距過近、癲癇等[4-6]，此外，約70%以上的SOD病人的下丘腦以及垂體發(fā)育異常，會出現(xiàn)功能障礙并導(dǎo)致生長激素、甲狀腺素刺激素、腎上腺皮質(zhì)激素缺乏，最終表現(xiàn)為生長受阻或停滯[7-8]。CPHD是由于生長激素缺乏導(dǎo)致的多種垂體前葉激素缺乏的疾病，最常見病因之一是PROP1基因發(fā)生突變。正常狀態(tài)下，Hesx1基因能夠與PROP1基因結(jié)合形成二聚體，具有拮抗作用，因此，Hesx1基因?qū)Υ贵w前葉激素的分泌具有重要的調(diào)控作用[9-11]。綜上所述，Hesx1基因通過對前腦與腦垂體的影響，對動物的生長發(fā)育起到至關(guān)重要的作用，目前，國際上很少有關(guān)于Hesx1基因在家畜上的研究報(bào)道，極大多數(shù)是對人類Hesx1基因突變所引起疾病的研究[12-14]，以及對小鼠等模型動物的相關(guān)研究報(bào)道[15]，而在牦牛上未見相關(guān)報(bào)道。本研究首次在無角牦牛上對Hesx1基因多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，從而揭示Hesx1的基因效應(yīng)，以期為牦牛的育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物及生長性狀測定

選取青海大通牛場的6月齡斷奶無角牦牛共計(jì)364頭組建試驗(yàn)群體，根據(jù)耳號編寫生長數(shù)據(jù)記錄冊，同時測定所有6月齡無角牦牛的生長性狀(包括體質(zhì)量、體高、體斜長、胸圍)，靜脈采集血液樣本并根據(jù)耳號編號記錄。將所有供試6月齡無角牦牛在相同管理?xiàng)l件下自然放牧至18月齡，整個試驗(yàn)期間無角牦牛于天然牧場自由行走、采食、飲水，分別測定并記錄12、18月齡時無角牦牛的生長性狀。

1.2 無角牦牛血液DNA的提取及保存

按照OMEGA BIO-TEK血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作流程進(jìn)行基因組DNA的提取，經(jīng)Thermo Fisher Scientific公司(美國)的NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測合格后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 無角牦牛Hesx1基因的引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI中野牦牛的Hesx1基因序列(GenBank登錄號為NW_005392951.1)，分別將Hesx1基因的5′UTR、4個外顯子及部分內(nèi)含子、3′UTR依次命名為hⅠ—hⅥ，然后對hⅠ與hⅡ基因座進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，引物由西安擎科澤西生物公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL：超純水7 μL，2×Pfu PCR MasterMix(不含染料)10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR的擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃或57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 無角牦牛Hesx1基因的PCR-SSCP檢測和DNA片段測序

將變性緩沖液(98%去離子甲酰胺、0.025%二甲苯青、0.025%溴酚藍(lán)、0.037% Na2EDTA)與PCR產(chǎn)物按7∶3的比例加入離心管中(置于冰中)，振蕩混勻后于98 ℃金屬浴變性10 min，然后迅速置于冰中10～15 min。在4 ℃恒溫箱中于150～170 V電壓下進(jìn)行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳4～6 h，然后使用銀染法進(jìn)行基因型判定，最后將不同帶型的PCR產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測序。

表1 Hesx1基因多態(tài)性檢測引物Tab.1 Primers used to detect polymorphism of Hesx1 gene

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR-SSCP檢測結(jié)果，對多態(tài)基因座的不同基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測序結(jié)果用Lasergene軟件包里的Seq-Man進(jìn)行序列對比?；蛐皖l率、等位基因頻率、雜合度、有效等位基因頻率及多態(tài)信息含量等群體遺傳參數(shù)用POPGENE和PCI-CALC等分析軟件進(jìn)行計(jì)算。用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行哈代-溫伯格平衡的計(jì)算。生長性狀的關(guān)聯(lián)分析用SPSS 20.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 無角牦牛Hesx1基因的PCR擴(kuò)增

分別設(shè)計(jì)引物對無角牦牛Hesx1基因的hⅠ與hⅡ基因座序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，分別得到272 bp和463 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符，條帶清晰且沒有拖帶，特異性良好(圖1A和圖1B)，均可直接進(jìn)行PCR-SSCP分析。

M：DL600 DNA Marker；1—5：無角牦牛Hesx1基因hⅠ和hⅡ基因座的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 無角牦牛Hesx1基因的SSCP檢測

由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后顯示，無角牦牛Hesx1基因hⅠ與hⅡ基因座均檢測出2種帶型，分別命名為GG、GC與TT、TC。

圖2 無角牦牛hⅠ(A)和hⅡ(B)基因座不同基因型的電泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of different genotypes of hⅠ(A) and hⅡ(B) loci in polled yak

2.3 無角牦牛Hesx1多態(tài)基因型測序

將不同帶型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果在NCBI(GenBank)中與野牦牛Hesx1基因的序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，無角牦牛Hesx1基因hⅠ基因座中(位于5′UTR中的第-618位)發(fā)生單個堿基突變：G→C(圖3A和3B)，hⅡ基因座中(位于Intron 1中的第+226位)發(fā)生單個堿基突變：T→C(圖3C和3D)。

A：GC基因型測序；B：GG基因型測序；C：TT基因型測序；D：TC基因型測序

2.4 無角牦牛Hesx1基因遺傳多態(tài)性分析

如表2所示，無角牦牛Hesx1基因hⅠ基因座中基因型頻率大小為GG>GC；hⅡ基因座中基因型頻率大小為TT>TC。通過卡方檢驗(yàn)可知，牦牛群體顯著偏離哈代-溫伯格平衡(P<0.05)。無角牦牛Hesx1基因hⅠ與hⅡ基因座的遺傳多態(tài)性見表3，PIC含量分別為0.296與0.348，均為中度多態(tài)性(0.25

表2 無角牦牛Hesx1基因hⅠ與hⅡ基因座的基因型頻率和等位基因頻率Tab.2 Genotype frequency and allele frequency of hⅠ and hⅡ loci of Hesx1 gene in polled yak

注：括號內(nèi)表示個體數(shù)，*表示顯著偏離哈代-溫伯格平衡(P<0.05)，**表示極顯著偏離(P<0.01)。

Note: The number of individuals is shown in parentheses, * indicates a significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.05), and ** indicates a very significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.01).

表3 無角牦牛Hesx1基因hⅠ與hⅡ基因座的遺傳多態(tài)性Tab.3 Genetic polymorphism of hⅠ and hⅡ loci of Hesx1 gene in polled yak

注：PIC>0.5為高度多態(tài)，0.25

Note: PIC>0.5 is highly polymorphic, 0.25

2.5 無角牦牛Hesx1基因多態(tài)基因座與生長性狀關(guān)聯(lián)分析

由表4可知，對Hesx1基因hⅠ基因座與無角牦牛3個月齡的生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，hⅠ基因座對6月齡無角牦牛的體質(zhì)量、體高、胸圍均有極顯著影響(P<0.01)，且均為雜合GC型極顯著大于純合GG型的個體，但對體斜長影響不顯著(P>0.05)；對12月齡無角牦牛的體質(zhì)量有顯著影響(P<0.05)，雜合GC型顯著大于純合GG型的個體，對體斜長、胸圍均有極顯著影響(P<0.01)，雜合GC型均極顯著高于純合GG型的個體；對18月齡無角牦牛的體質(zhì)量有顯著影響(P<0.05)，雜合GC型顯著大于純合GG型的個體，對體高、體斜長、胸圍均無顯著影響(P>0.05)。對Hesx1基因hⅡ基因座與無角牦牛3個月齡的生長性狀關(guān)聯(lián)分析可知，hⅡ基因座對6月齡無角牦牛的體質(zhì)量、體高、體斜長、胸圍均無顯著影響(P>0.05)；對12月齡無角牦牛的體質(zhì)量有極顯著影響(P<0.01)，且雜合TC型極顯著大于純合TT型的個體，對體高、胸圍均有顯著影響(P<0.05)，且雜合TC型顯著高于純合TT型的個體，對體斜長無顯著影響(P>0.05)；對18月齡無角牦牛的體質(zhì)量、體高、體斜長、胸圍均無顯著影響(P>0.05)。因此，在hⅠ、hⅡ基因座中雜合型GC、TC個體生長性狀優(yōu)于純合型個體，為優(yōu)勢基因型，對無角牦牛的生長性狀有一定的正面影響。

表4 無角牦牛Hesx1基因hⅠ與hⅡ基因座不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Correlation analysis between different genotypes of hⅠ and hⅡ loci of Hesx1 gene and production traits in polled yak

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: In the same column of data,there are significant differences when marked in different lowercase (P<0.05) and different uppercase (P<0.01).

3 結(jié)論與討論

Hesx1是動物前腦與腦垂體早期發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，而垂體前葉是調(diào)控動物生長發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及生殖的重要調(diào)節(jié)中樞，突變個體常表現(xiàn)為GH、FSH、LH、ACTH等的缺乏[16]，其中GH直接關(guān)系到動物的生長，因此，Hesx1基因?qū)游锏纳L性狀有重要的影響。通過PCR-SSCP與DNA測序技術(shù)對秦川牛、南陽牛、郟縣紅牛、中國荷斯坦奶牛4個品種的Hesx1基因編碼區(qū)全部外顯子及部分內(nèi)含子、5′UTR與3′UTR進(jìn)行檢測，在5′UTR、Intron1和第四外顯子中各發(fā)現(xiàn)1個SNP，并且只在秦川牛、南陽牛、郟縣紅牛這3個群體中，在中國荷斯坦奶牛中并未發(fā)現(xiàn)；對有SNP的3個基因座與生長性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，5′UTR突變點(diǎn)對3個地方品種牛的生長性狀沒有顯著影響，但I(xiàn)ntron1突變點(diǎn)對18月齡南陽牛的日增體質(zhì)量有顯著影響，且野生型(TT)個體顯著大于突變型(TC)個體，而第四外顯子突變點(diǎn)對郟縣紅牛的胸圍、體質(zhì)量、體斜長有顯著影響，且野生型(TT)個體顯著大于突變型(TA或AA)，對6月齡南陽牛的體質(zhì)量和平均日增體質(zhì)量、12月齡南陽牛的體質(zhì)量和胸圍有顯著影響，且野生型(TT)個體顯著或極顯著大于突變型(AA)，對秦川牛的十字部高、腰角寬、胸圍及體質(zhì)量有顯著影響，且野生型(TT)個體顯著大于突變型(AA)個體[2,17-18]。藍(lán)賢勇等[19]利用混合DNA池測序技術(shù)，對山羊(包括6個品種1 391個個體)Hesx1基因的全部外顯子位點(diǎn)進(jìn)行測序，掃描SNP位點(diǎn)，然后利用酶切技術(shù)分出不同品種的基因型，在此基礎(chǔ)上再通過關(guān)聯(lián)分析得出，Hesx1基因?qū)ξ鬓r(nóng)薩能奶山羊的體高、體長、胸圍無顯著影響；對內(nèi)蒙古絨山羊的絨厚、絨長、產(chǎn)絨量無顯著影響；但對山羊的體質(zhì)量有顯著影響，且2、4歲山羊的AA基因型個體顯著大于AG型的個體。

本研究通過PCR-SSCP和DNA測序技術(shù)檢測分析了無角牦牛Hesx1基因hⅠ與hⅡ基因座的多態(tài)性，通過與無角牦牛3個不同月齡的生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，突變雜合型GC與TC均為優(yōu)勢基因型，對無角牦牛的生長性狀具有一定的正面影響。初步推斷，Hesx1基因的hⅠ和hⅡ基因座可為牦牛的分子標(biāo)記輔助育種提供參考，但也需要進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)群體的數(shù)量并增加對Hesx1基因其他多態(tài)位點(diǎn)的深入研究，以期為肉用牦牛的品種選育提供更加豐富的理論依據(jù)。