楊育峰，張曉申，王慧瑜，王雁楠，徐心志，陳獻(xiàn)功，張 莉，楊曉平，楊國紅，平西栓

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002； 2.鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所，河南 鄭州 450005； 3.河南省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，河南 鄭州 450002)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam]是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和生物能源作物，在我國甚至世界糧食安全和能源安全中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。河南省是我國甘薯主產(chǎn)省，甘薯種植歷史悠久，常年種植甘薯45萬hm2左右，并呈逐年增加趨勢[4]。近些年，甘薯病毒病的大范圍發(fā)生對我國甘薯的產(chǎn)量及品質(zhì)產(chǎn)生了巨大影響，其中，由甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒協(xié)生共侵染引起的甘薯病毒病是目前甘薯最嚴(yán)重的病毒病之一，感染病毒病的甘薯一般減產(chǎn)20%～50%，嚴(yán)重的甚至絕收，已成為甘薯生產(chǎn)的重要限制因素之一。據(jù)估計(jì)，我國每年因甘薯病毒病造成的損失高達(dá)40億元[5-9]。目前，由于缺乏抗病毒病的甘薯品種和高效的防治方法，再加上病毒對寄主植物具有高度的依賴性，甘薯脫毒及防護(hù)栽培成為目前防治甘薯病毒病的有效方法之一[10]。

鄭紅22是河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所與江蘇省徐州甘薯研究中心聯(lián)合選育而成的一個(gè)兼用型甘薯品種，2010 年3月通過國家甘薯品種鑒定委員會鑒定，鑒定編號為國品鑒甘薯2010004，該品種紫紅皮、橘黃肉，品質(zhì)優(yōu)良，食味較好，高抗莖線蟲病，抗根腐病，中抗黑斑病[11]。鄭紅22雖然綜合抗病性較好，但是對甘薯病毒病抗性較差，尤其易感染甘薯卷葉病毒，這對該品種的進(jìn)一步推廣造成了較大的影響。本研究以兼用型甘薯品種鄭紅22為材料，篩選適合鄭紅22莖尖再生的分化培養(yǎng)基，并對鄭紅22脫毒再生植株進(jìn)行擴(kuò)繁和移栽，探討不同密度及肥料配比對脫毒鄭紅22鮮薯產(chǎn)量的影響，旨在篩選適宜鄭紅22的高效脫毒及栽培技術(shù)，為鄭紅22的進(jìn)一步示范應(yīng)用及高效生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試甘薯為兼用型品種鄭紅22。供試氮肥為尿素(河南心連心化肥有限公司生產(chǎn)，含N 46.4%)，磷肥為過磷酸鈣(湖北莊園肥業(yè)有限公司生產(chǎn)，含P2O512%)，鉀肥為硫酸鉀(浙江農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，含K2O 52%)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莖尖再生 取鄭紅22旺盛生長的莖尖部分(約30 mm長)，用自來水沖洗干凈后，先用70%的乙醇消毒30 s，然后立即用0.1%的升汞殺菌處理6～8 min，最后用無菌水沖洗3～4次。在解剖顯微鏡下剝?nèi)￠L度為0.2～0.5 mm的莖尖分生組織(帶1～2片葉原基)，放在含有不同濃度NAA(萘乙酸)、6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)的MS培養(yǎng)基(pH值5.8)上，在(27±l)℃，每日13 h、3 000 lx的光照下進(jìn)行培養(yǎng)，以誘導(dǎo)芽的分化。

先后2次共設(shè)計(jì)13種分化培養(yǎng)基進(jìn)行鄭紅22莖尖再生研究，其中第1次設(shè)9個(gè)處理，NAA質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2 mg/L，6-BA質(zhì)量濃度分別為0、1、2 mg/L。第2次在第1次研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)4個(gè)處理，NAA質(zhì)量濃度均為0.1 mg/L，6-BA質(zhì)量濃度分別為2、3、4、5 mg/L。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)30～40個(gè)莖尖。分析比較不同分化培養(yǎng)基的再生效果。

1.2.2 再生植株脫毒檢測 待再生植株長成完整植株后，將其在MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代和擴(kuò)繁培養(yǎng)。取繼代培養(yǎng)21 d之內(nèi)的幼嫩植株，分別提取DNA或RNA，采用喬奇等[12]的PCR檢測法對甘薯卷葉病毒(SPLCV)、甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)和甘薯G病毒(SPVG)4種重要病毒進(jìn)行檢測。同時(shí)，將試管苗進(jìn)一步移栽至隔離條件較好的防蟲溫室內(nèi)，并在花盆中種植指示植物巴西牽牛，待試管苗移栽成活后，將待檢測植株嫁接到健康巴西牽牛上，觀察顯癥情況。

1.2.3 脫毒苗密度及肥料配比試驗(yàn) 試驗(yàn)在鄭州市須水鎮(zhèn)三十里鋪村進(jìn)行，土壤為輕壤土，中等肥力，光照、排水條件好。小區(qū)采取隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)6壟，單壟單行，壟距0.8 m，壟長5 m，小區(qū)之間留寬1.5 m的過道。每個(gè)處理3次重復(fù)，采用鄭紅22脫毒苗，收獲時(shí)測小區(qū)中間4行產(chǎn)量，取平均值。所用肥料均作為基肥在起壟前條施，常規(guī)田間管理。

密度試驗(yàn)共設(shè)41 250、48 750、56 250、63 750株/hm24個(gè)密度，N、P2O5、K2O施用量分別為75.0、75.0、150.0 kg/hm2，6月13日種植，10月16日收獲。

肥料試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)處理，N、P2O5、K2O施用量分別為0、75.0、180.0 kg/hm2，75.0、75.0、112.5 kg/hm2，75.0、75.0、180.0 kg/hm2，112.5、0、180.0 kg/hm2，112.5、75.0、0 kg/hm2，112.5、75.0、180.0 kg/hm2，112.5、112.5、112.5 kg/hm2， 112.5、112.5、180.0 kg/hm2和0、0、0 kg/hm2(不施肥)，土壤含堿解氮69.77 mg/kg、有效磷36.16 mg/kg、速效鉀87.45 mg/kg，種植密度為48 750株/hm2，6月10日種植，10月15日收獲。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分化培養(yǎng)基對鄭紅22莖尖植株再生的影響

將鄭紅22莖尖分生組織在添加NAA和6-BA的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d左右，莖尖分生組織開始膨大、變綠，直徑1～2 mm。培養(yǎng)14～21 d，形成直徑3～5 mm的淺綠色或淺黃色的愈傷組織，愈傷組織形成率在63.63% 以上(表1)。培養(yǎng)40 d左右，愈傷組織繼續(xù)變大，顏色逐漸變成黃綠色，愈傷組織陸續(xù)再生出植株。將再生植株轉(zhuǎn)移到MS基本培養(yǎng)基上，進(jìn)一步發(fā)育成完整植株。

在第1次鄭紅22的莖尖分生組織再生試驗(yàn)中，共接種873個(gè)莖尖分生組織，培養(yǎng)獲得730個(gè)愈傷組織，其中，68個(gè)愈傷組織再生獲得68株植株，在分別添加0.1 mg/L NAA和2 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)的莖尖分生組織得到了最高的植株再生率，為48.64%，極顯著高于其他分化培養(yǎng)基處理(表1)。在第2次鄭紅22的莖尖分生組織再生試驗(yàn)中，共接種428個(gè)莖尖分生組織，培養(yǎng)獲得389個(gè)愈傷組織，其中，172個(gè)愈傷組織再生獲得172株植株，在添加0.1 mg/L NAA和3 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)的莖尖分生組織的平均再生率最高，為54.58%，高于其他分化培養(yǎng)基處理(表1)。鄭紅22莖尖分生組織在不同分化培養(yǎng)基上的植株再生率差異明顯，說明不同的激素種類及配比對鄭紅22莖尖植株再生的影響較大。

表1 不同分化培養(yǎng)基對鄭紅22莖尖植株再生的影響Tab.1 Effect of different differentiation media on plant regeneration from stem apex of Zhenghong 22

續(xù)表1 不同分化培養(yǎng)基對鄭紅22莖尖植株再生的影響Tab.1(continued) Effect of different differentiation media on plant regeneration from stem apex of Zhenghong 22

注：同列數(shù)據(jù)后的不同大、小寫字母分別表示在1%、5%水平上差異顯著，下同。

Note: The different uppercase，lowercase letters after data of the same column mean significant differences at 1%,5% levels among different treatments,respectively，the same below.

2.2 鄭紅22再生植株脫毒檢測

從所有再生植株中隨機(jī)挑選了57個(gè)再生株系，分別對SPLCV、SPFMV、SPCSV和SPVG 4種重要病毒進(jìn)行PCR檢測，其中,5個(gè)株系均不含有這4種病毒，進(jìn)一步將這5個(gè)株系嫁接到指示植物巴西牽牛上，均未見指示植物顯癥，脫毒率為8.77%。

2.3 不同種植密度對脫毒鄭紅22鮮薯產(chǎn)量的影響

由表2可知，隨著種植密度的增加，脫毒鄭紅22的產(chǎn)量先增加后降低，當(dāng)種植密度為48 750株/hm2時(shí)，鮮薯產(chǎn)量最高，為46 906.78 kg/hm2，種植密度為63 750株/hm2時(shí)，鮮薯產(chǎn)量最低，為41 295.64 kg/hm2，兩者差異達(dá)到了極顯著水平；在種植密度分別為41 250株/hm2和56 250株/hm2下，鮮薯產(chǎn)量略低于密度48 750株/hm2處理，差異不顯著。因此，適宜的種植密度可以構(gòu)建甘薯高產(chǎn)合理群體結(jié)構(gòu)，提高光能利用效率，促進(jìn)薯塊膨大，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)高效。

表2 不同種植密度對脫毒鄭紅22鮮薯產(chǎn)量的影響Tab.2 Effect of different planting densities on fresh sweet potato yield of virus-free Zhenghong 22

2.4 不同肥料配比對脫毒鄭紅22鮮薯產(chǎn)量的影響

從表3可以看出，當(dāng)N、P2O5、K2O施用量分別為75.0、75.0、180.0 kg/hm2時(shí)，鮮薯產(chǎn)量最高，為47 555.02 kg/hm2,比不施肥處理極顯著提高16.09%， 比N、P2O5、K2O施用量分別為112.5、75.0、0 kg/hm2處理顯著提高，與其他處理之間的差異均不顯著，表明只有合適的肥料配比及用量才能促使脫毒鄭紅22合理吸收養(yǎng)分，進(jìn)一步促進(jìn)薯塊的膨大，提高產(chǎn)量，氮、磷、鉀肥的不合理施用反而對薯塊的膨大不利。

表3 不同肥料配比對脫毒鄭紅22鮮薯產(chǎn)量的影響Tab.3 Effect of different proportion of nitrogen,phosphorus and potassium fertilizers on fresh sweet potato yield of virus-free Zhenghong 22

3 結(jié)論與討論

研究表明， NAA、6-BA等對甘薯莖尖分生組織的再生具有較大的影響，適宜濃度的NAA 和6-BA組合能有效促進(jìn)甘薯莖尖分生組織再生成植株[13-14]。本研究采用不同質(zhì)量濃度的NAA 和6-BA組合研究鄭紅22的莖尖分生組織植株再生體系發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MS固體培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L NAA和3 mg/L 6-BA時(shí)，平均再生率最高，為54.58%。李曉青等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MS固體培養(yǎng)基中添加NAA 0.5 mg/L和6-BA 1.0 mg/L 時(shí)，商薯19莖尖分生組織的再生率最高，為66.67%。周杰等[16]對臺農(nóng)71等10個(gè)菜用型甘薯品種進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MS固體培養(yǎng)基中6-BA添加量為2.0 mg/L時(shí)，部分品種莖尖分生組織的再生率在75%以上，部分品種的再生率在50%以下。周志林等[17]在添加 NAA 0.05 mg/L、6-BA 2.0 mg/L的MS培養(yǎng)基上對徐菜薯1號莖尖分生組織進(jìn)行培養(yǎng)，再生率為48.3%。這說明不同甘薯品種及激素配比獲得的莖尖分生組織再生率存在較大的差別。

本研究隨機(jī)挑選的57個(gè)再生株系的脫毒率僅為8.77%，可能與所培養(yǎng)莖尖大小、基因型、形態(tài)等因素有關(guān)。盧玲等[18]對高淀粉甘薯品種美國 SL-9進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，所培養(yǎng)莖尖大小與甘薯莖尖組織培養(yǎng)的成活率呈正比，與莖尖的脫毒效果呈反比。黃遠(yuǎn)新等[19]對不同葉原基形態(tài)的莖尖分生組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，獲得最佳脫毒效果的葉原基形態(tài)為葉原基突起態(tài)，其次是半閉合態(tài)和閉合態(tài)。另外，不同研究使用的檢測方法、檢測的病毒種類、檢測的靈敏度及嚴(yán)格程度等的不同也可能造成脫毒率不同。本研究采用了較大群體的組織培養(yǎng)，所得結(jié)果比較可靠，本研究確立的鄭紅22莖尖植株再生體系將為鄭紅22的進(jìn)一步應(yīng)用及高效生產(chǎn)等提供有效的技術(shù)支持。在今后的研究中，將對更多的激素濃度及配比、苗預(yù)處理等方法進(jìn)行研究，進(jìn)一步獲得更高效的適合鄭紅22等甘薯品種的脫毒技術(shù)。

本研究密度試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著種植密度的增加，脫毒鄭紅22的鮮薯產(chǎn)量先增加后減少，當(dāng)種植密度為48 750株/hm2時(shí)，鮮薯產(chǎn)量最高，為46 906.78 kg/hm2，這說明適宜的種植密度可以提高鮮薯產(chǎn)量，隨著種植密度的繼續(xù)增加，群體增大，田間通透性變差，個(gè)體長勢弱，從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低，這與呂樹立等[20]的研究結(jié)果一致。本研究肥料試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)N、P2O5、K2O施用量分別為75.0、75.0、180.0 kg/hm2時(shí)，鮮薯產(chǎn)量最高。這可能是因?yàn)楦适硎堑湫偷南测涀魑?，增施鉀肥可以促進(jìn)甘薯地上部與地下部的協(xié)調(diào)生長，進(jìn)一步促進(jìn)甘薯地上部干物質(zhì)向塊根運(yùn)轉(zhuǎn)和分配，從而提高甘薯塊根產(chǎn)量[21]。因此，合理的種植密度和施肥量是甘薯產(chǎn)量形成的重要因素，從本研究結(jié)果來看，在種植密度為48 750株/hm2，N、P2O5、K2O施用量分別為75.0、75.0、180.0 kg/hm2時(shí)，有利于脫毒甘薯鄭紅22獲得高產(chǎn)。