李單祎 武 昕

一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物體內(nèi)一種生物調(diào)節(jié)性介質(zhì)，具有許多生物學活性，參與機體多種生理病理過程。NO具有擴張血管，增加血管內(nèi)皮通透性，與血管生長因子相互作用，促進血管生成的作用。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是作用于L—精氨酸和O2生成NO的關(guān)鍵酶，NOS包括三種同工酶，即神經(jīng)型(nNOS)，誘導型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)。外陰色素減退性疾病，又稱外陰上皮非瘤樣病變，是一組以瘙癢為主要癥狀、外陰皮膚色素減退為主要體征的外陰皮膚疾病，主要包括外陰慢性單純性苔蘚(lichen simplex chronicus，LSC)和外陰硬化性苔蘚(lichen sclerosus，LS)，病因及發(fā)病機制尚未闡明[1]。LSC先前的疾病名“外陰鱗狀上皮增生”已不再采用。本研究目的是檢測iNOS和eNOS在外陰正常皮膚、LSC和LS中的表達，并以人原始造血細胞抗原(CD34)標記微血管內(nèi)皮細胞，測量各組織的微血管密度(MVD)，探討iNOS和eNOS與LSC和LS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本 選取中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理教研室1998-2014年存檔的蠟塊：外陰慢性單純性苔蘚(LSC)30例，外陰硬化性苔蘚(LS)30例，外陰正常皮膚10例。

1.1.2 試劑 兔抗人iNOS、eNOS多克隆抗體(工作濃度1∶100)，兔抗人CD34多克隆抗體(工作濃度1∶80)，即用型SABC試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學方法 免疫組織化學SABC法。

1.2.2 結(jié)果判定 iNOS和eNOS蛋白定位在細胞漿中，以棕黃色顆粒細胞為陽性細胞。在高倍鏡下(400)任意選取5個視野，計數(shù)平均的陽性細胞數(shù)，取5個數(shù)值的平均數(shù)作為陽性細胞數(shù)。CD34蛋白主要定位于細胞漿中，呈棕黃色顆粒。陽性標準按Weidner等[2]方法檢測，每張切片選擇3個血管最密集的區(qū)域(新生血管熱點區(qū))，在高倍鏡下(400)隨機計數(shù)5個視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均值作為MVD值。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)資料用SPSS 13.0進行處理，各組計量資料的結(jié)果采用t檢驗，比較iNOS和eNOS表達的一致性采用Kappa檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 iNOS和eNOS在LSC和LS中的表達 在外陰正常皮膚中無表達。在LSC和LS中陽性細胞表達于真皮淺層，在表皮細胞中不表達。iNOS在LSC和LS中陽性細胞多表達于淋巴細胞、少量漿細胞及血管內(nèi)皮細胞。eNOS在LSC和LS中陽性細胞多表達于血管內(nèi)皮細胞(圖1、2，棕黃色顆粒為陽性細胞)。LSC中iNOS和eNOS的表達高于LS(P<0.05)。見表1。

2.2 CD34蛋白在外陰正常皮膚、LSC、LS中的表達及MVD值 CD34蛋白在外陰正常皮膚、LSC、LS中均呈陽性表達。CD34在血管內(nèi)皮細胞中表達，在新生血管內(nèi)皮中表達遠大于非新生血管內(nèi)皮(圖3、4，棕黃色顆粒為陽性細胞)。LSC中MVD高于LS(P<0.05)，LS的MVD低于外陰正常皮膚(P<0.05)。見表2。

表1 iNOS和eNOS蛋白在LSC和LS中的表達

注：*表示P<0.05

圖1 iNOS在LSC中的陽性表達(SABC，×100) 圖2 eNOS在LS中的陽性表達(SABC，×100)圖3 CD34在LSC中的陽性表達(SABC，×100) 圖4 CD34在LS中的陽性表達(SABC，×100)

表2 外陰正常皮膚、LSC、LS中的MVD值

注：*表示P<0.05

2.3 iNOS和eNOS在LSC、LS中表達的關(guān)系 見表3。

3 討論

由NOS合成的NO是人體內(nèi)重要的信號分子，其功能復雜。生理濃度的NO(pmoL或fmoL水平)參與信息傳遞和細胞保護作用，而過量的NO(nmoL水平)見于病理刺激和炎癥反應時。iNOS一經(jīng)誘導生成，即大量合成NO介導炎癥發(fā)生，誘導血管生成，可加重炎癥反應過程。iNOS可間接激活eNOS，使其在病理情況下表達增加，經(jīng)eNOS產(chǎn)生的NO起到擴張血管、增加微循環(huán)通透性的作用，保證血液供應。CD34是一種血管內(nèi)皮標志物，且敏感性較強，因此用CD34可測量組織內(nèi)微血管密度(MVD)，MVD是血管生成的定量指標。

表3 iNOS和eNOS在LSC、LS中表達的關(guān)系

注：Kappa=0.811,P<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)，在外陰正常皮膚中，無iNOS蛋白表達；在LSC中，iNOS蛋白表達上調(diào)。LSC主要病理表現(xiàn)為鱗狀上皮表層細胞的角化過度和角化不全，棘層細胞增生，真皮淺層纖維化并伴有不等量炎癥細胞浸潤[1]。目前病因不清，可能與機體免疫狀況和局部炎性刺激及對其他外來刺激反應過度有關(guān)[3]。NOS在人體內(nèi)廣泛分布，其中血管內(nèi)皮細胞是最集中部位[4]。祝青[5]研究表明IL-12、IFN-γ在外陰白色病變組織中高表達。李娟等[6]研究表明IFN-γ在外陰鱗狀上皮增生組織中高表達。IL-1、IL-12、IFN-γ、TNF-α等炎性介子刺激并誘導真皮內(nèi)單核巨噬細胞、中性粒細胞和血管平滑肌細胞等產(chǎn)生iNOS。經(jīng)iNOS產(chǎn)生的NO對淋巴細胞、漿細胞的趨化性有促進作用，有利于炎細胞的浸潤。因此，在真皮組織中有大量炎細胞浸潤，可能與NO的趨化作用有一定關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，LSC和外陰正常皮膚的MVD值比較無顯著性差異(P>0.05)，說明LSC病變并沒有引起血管數(shù)目的明顯增多，但iNOS表達增多，使血管擴張、滲透性增加，這一點與LSC真皮組織內(nèi)炎癥的形成相一致。李紅鋼等[7]研究顯示在支氣管黏膜上皮增生和鱗狀化生中有iNOS的表達，并提示iNOS參與了支氣管黏膜增生和鱗狀化生的炎癥過程。張小艷等[8]研究顯示在幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎中有iNOS的表達，iNOS促進炎癥反應發(fā)生，加重胃黏膜損傷，促進腸上皮化生的形成，甚至異型增生。張麗霞等[9]研究顯示iNOS在肛周尖銳濕疣皮損中高表達可能促進尖銳濕疣細胞增殖及真皮乳頭血管形成，參與其發(fā)病。本研究在LSC表皮并無iNOS的表達，而是表達于真皮淺層，分析在LSC中iNOS與表皮增生可能相關(guān)系，iNOS參與LSC真皮內(nèi)炎癥過程中的血管擴張。

在外陰正常皮膚中，無eNOS蛋白表達；在LSC中，eNOS蛋白表達上調(diào)。研究認為在炎癥損傷修復過程中，eNOS在乙酰膽堿作用下由內(nèi)皮細胞合成釋放，iNOS又可間接激活eNOS，經(jīng)eNOS產(chǎn)生的NO參與調(diào)節(jié)血壓和器官的血流分布，阻止腎素-血管緊張素的產(chǎn)生，通過調(diào)節(jié)血管的舒縮功能，保證血管擴張，在血液供應上很重要。因此，在LSC中，經(jīng)eNOS產(chǎn)生的NO起到調(diào)節(jié)血流分布、擴張血管、調(diào)節(jié)血管的口徑和流量、增加微循環(huán)通透性的作用，同樣起到加重真皮內(nèi)炎癥反應，促上皮細胞再生的作用。而LSC和外陰正常皮膚的MVD值相比較無顯著性差異(P>0.05)，也提示eNOS參與了SH真皮內(nèi)炎癥過程中的血管擴張。

在LS中，iNOS和eNOS蛋白也均有表達。LS的病理表現(xiàn)為表皮變薄，過度角化及黑素細胞減少，上皮腳變鈍或消失；上皮下毛細血管減少，管壁變薄，膠原纖維變性，呈勻質(zhì)帶改變[1]。LS病因不明，目前認為是一種自身免疫性疾病，初期免疫增強，破壞真皮內(nèi)微血管，造成局部組織缺氧，膠原纖維變性，加重表皮細胞的代謝障礙[3]。LS的MVD低于外陰正常皮膚，其值比較有顯著性差異(P<0.05)，證實了LS真皮組織內(nèi)存在微循環(huán)障礙。這與楊靜等[10]CD34在外陰病變中的研究結(jié)果相一致。iNOS在LS中表達上調(diào)，提示在微循環(huán)障礙所致的缺血缺氧狀態(tài)下，誘導iNOS的產(chǎn)生，其生成的NO可能有擴張血管的作用，從而代償性地改善LS的血液循環(huán)狀態(tài)。iNOS間接激活eNOS，生成的NO也具有擴張血管的作用，而在LS中eNOS表達上調(diào)進一步證實了這一點。

iNOS和eNOS在LSC中的表達明顯高于LS，兩者相比較有顯著性差異(P<0.05)，LSC的MVD值也明顯高于LS，兩者比較也有顯著性差異(P<0.05)。說明iNOS和eNOS在LSC中的擴張血管作用是增加炎癥的滲出，而在LS中的擴張血管作用是增加血管口徑，改善微循環(huán)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在LSC和LS中，iNOS表達陽性時eNOS也較多呈陽性表達，iNOS表達陰性時eNOS大部分也為陰性，兩者呈明顯正相關(guān)(P<0.05)。推測iNOS和eNOS之間可能存在協(xié)同效應，共同催化產(chǎn)生NO，參與LSC真皮內(nèi)炎癥過程中的血管擴張，在LS真皮中擴張血管，代償性地改善LS的血液循環(huán)狀態(tài)。

綜上所述，NOS在LSC和LS中均參與了疾病的發(fā)展過程，因此，以NOS/NO為靶點治療，應用NOS抑制劑，可能為LSC和LS的臨床治療開辟新途徑。