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        慢性自發(fā)性蕁麻疹患者外周血嗜堿粒細胞CD63和CD203c的表達

        2019-08-23 01:35:58曹艷云曹秀妮蔡海斌徐順明
        中國麻風(fēng)皮膚病雜志 2019年8期
        關(guān)鍵詞:風(fēng)團蕁麻疹持續(xù)時間

        孔 偉 曹艷云 曹秀妮 徐 徉 蔡海斌 徐順明

        慢性自發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticarial, CSU)是指不論病因是否清楚,不依賴于任何外源性物理刺激,由內(nèi)源性因素引起的慢性蕁麻疹[1]。嗜堿粒細胞和肥大細胞與CSU的發(fā)病機制相關(guān),雖然嗜堿粒細胞占體內(nèi)白細胞的比例不到1%,但它是IgG介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的主要參與者之一,且能募集促炎細胞,如嗜酸粒細胞和中性粒細胞[2]。此外,嗜堿粒細胞有多種表面標志物表達,其中CD63和CD203c是判斷嗜堿粒細胞活化和分化最有效的標志物[3,4]。

        我們采用流式細胞術(shù)檢測風(fēng)團持續(xù)不同時間以及治療后風(fēng)團消退、病情暫時控制的CSU患者外周血中嗜堿粒細胞CD63和CD203c的表達水平,評估嗜堿粒細胞在風(fēng)團不同狀態(tài)下的活化情況,探討外周血嗜堿粒細胞活化在CSU發(fā)病機制中的意義。

        1 材料與方法

        1.1 一般資料

        1.1.1 研究對象 隨機選擇本科室2017年12月至2018年12月前來就診的CSU患者。病例入選標準:(1)18~65歲;(2)風(fēng)團單個皮損持續(xù)時間<24 h,反復(fù)發(fā)作6周以上,每周至少發(fā)作2次;(3)無過敏性鼻炎,哮喘,特異性皮炎等過敏性疾病病史;無寄生蟲感染及自身免疫性疾病病史;(4)符合慢性自發(fā)性蕁麻疹診斷標準。排除標準:(1)妊娠及哺乳期婦女;(2)遺傳性血管性水腫、慢性可誘導(dǎo)性蕁麻疹和其他類型慢性蕁麻疹;(3)過去3天內(nèi)使用過抗組胺藥物,過去4周內(nèi)已使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、止血或抗凝血藥;(4)合并皮炎、濕疹等引起瘙癢的皮膚病。(5)嚴重的系統(tǒng)性疾病,包括心臟病、嚴重肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病,慢性感染、精神病、惡性腫瘤、高血壓、糖尿病、吸毒和酗酒患者等。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準,所有患者及健康對照均簽署知情同意書。評分標準[1]:患者入組,填寫臨床調(diào)查表,了解治療前的風(fēng)團情況與風(fēng)團持續(xù)時間、瘙癢癥狀、并進行量化評分。按下列兩項進行評價:評分相加即為總評分。(1)風(fēng)團數(shù)目:0分為無風(fēng)團;1分為風(fēng)團數(shù)<20個/24 h;2分為風(fēng)團數(shù)20~50個/24 h;3分為風(fēng)團數(shù)>50個/24 h,或有大面積風(fēng)團。(2)瘙癢程度:0分為無瘙癢;1分為輕度瘙癢;2分為中度瘙癢,但不影響日常生活和睡眠;3分為重度瘙癢,不能忍受,嚴重困擾日常生活和睡眠。治療方案選擇:選用一種或兩種新一代抗組胺藥物依巴斯汀片(10 mg,1/日,口服)和/或左西替利嗪膠囊(5 mg,1/晚,口服),如經(jīng)治療4周皮疹仍未控制者,納入剔除范圍。

        1.1.2 分組方法 共選取符合研究要求的CSU患者45例。按風(fēng)團持續(xù)時間與治療情況納入A、B、C三組。

        A組:風(fēng)團在2 h內(nèi)自行消退者15例,其中男性5例,女性10例,平均年齡(38.38±11.05)歲(22~61歲)。風(fēng)團未消退時采集血樣。B組:風(fēng)團持續(xù)12~24 h自行消退者15例,其中男性6例,女性9例,平均年齡(40.64±13.09)歲(21~61歲)。風(fēng)團未消退時采集血樣。C組:經(jīng)治療后風(fēng)團消退持續(xù)一周未復(fù)發(fā)者15例,其中男性6例,女性9例,平均年齡(32.83±13.07)歲(20~61歲)。D組:健康對照組,為門診體檢血常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂正常,既往無過敏性及系統(tǒng)性疾病健康者。15例,其中男性8例,女性7例,平均年齡(40.69±11.19)歲(22~58歲)。

        1.2 主要試劑與儀器 熒光標記單克隆抗體:美國BECKMAN COULTER公司Anti-HLA-DR-PC5、CD123-ECD、CD63-FITC、CD 203c-PE ,流式細胞儀為美國BECKMAN COULTER NAVIOS流式細胞分析系統(tǒng)。

        1.3 樣本采集與測定

        1.3.1 所有患者和健康對照者各抽血5 mL,靜置后4000 r/min(r=10 cm)離心5 min,留取上清,及時檢測。

        1.3.2 標本處理分別向已編好號的試管中加入10 μL單克隆抗體;分別向試管中加入混勻的100 μL抗凝血;混勻,避光,室溫孵育20~30 min;加入溶血劑500 μL,避光15 min;上機測樣。

        1.3.3 檢測及分析 每次檢測前均用Flow.Check熒光微球(Beckman Coulter)校準儀器,標本上機后,先以前向角散射光和側(cè)向角散射光參數(shù)大致觀察細胞形態(tài),選取有核細胞,排除細胞碎片和雜質(zhì)。選取CD123陽性而HLA-DR陰性的細胞即為嗜堿粒細胞,用CD63和CD203c雙參數(shù)進行分析。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件處理,數(shù)據(jù)資料以(均數(shù)±標準誤)表示,不同組間進行t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 FCM圖表現(xiàn) 先選取CD123+HLA-DR-的外周血嗜堿粒細胞,再選取CD63+CD203c+活化的嗜堿粒細胞,結(jié)果表明A、B、C三組較D組嗜堿粒細胞CD63+CD203c+的熒光強度增加,陽性率增高。見圖1。

        2.2 四組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達情況 結(jié)果顯示:與D組相比,A、B、C三組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達均顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);A、B、C三組兩兩之間比較無顯著差異(P>0.05);具體結(jié)果見表1。

        表1 CSU患者與健康對照組嗜堿粒細胞CD63+CD203c+表達情況

        注:*A、B、C三組分別與健康對照D組比較,均P<0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義;A、B、C三組間比較P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義

        圖1流式細胞儀檢測四組嗜堿粒細胞CD63和CD203c活化率

        2.3 各組之間嗜堿粒細胞活化率情況,結(jié)果表明A、B、C組活化率明顯高于D組,見圖2。

        圖2 各組嗜堿粒細胞CD63和CD203c活化百分率散點圖

        3 討論

        CSU是一種全身性的炎癥過敏性疾病,由于病因和發(fā)病機制不盡相同,風(fēng)團持續(xù)時間也各不相同。部分患者風(fēng)團持續(xù)<2 h能自行消退,也有患者風(fēng)團持續(xù)12~24 h方可消退。在CSU,風(fēng)團持續(xù)時間與患者生活質(zhì)量密切相關(guān),目前對于風(fēng)團持續(xù)時間無明確劃分標準,有分為<2 h和超過2 h者,以及<24 h和超過24 h者[5]。我們前期曾使用iTRAQ技術(shù)鑒定和驗證了風(fēng)團持續(xù)時間不同的CSU患者血清中差異表達的蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)風(fēng)團持續(xù)12~24 h組較<2 h組差異蛋白顯著[6],因此本研究沿用前期使用的標準,以風(fēng)團持續(xù)時間<2 h、12~24 h和治療后風(fēng)團有效控制的CSU患者進行分組。

        嗜堿粒細胞在慢性過敏性皮膚病中發(fā)揮著重要作用,與肥大細胞一樣,也是CSU的主要靶細胞[7]。嗜堿粒細胞有多種表面標志物,CD63和CD203c作為嗜堿粒細胞的主要激活標記物[8],基于其表達代表胞內(nèi)兩種不同的活化信號通路,且分別反映釋放組胺的不同方式,因此利用流式細胞術(shù)聯(lián)合檢測胞膜CD63、CD203c可全面評估CSU患者嗜堿粒細胞活化情況。

        既往研究表明,在CSU,外周血嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達增加[9],但表達水平與風(fēng)團持續(xù)時間以及病情活動之間的關(guān)聯(lián)尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,CSU風(fēng)團持續(xù)時間不同的A、B兩組和風(fēng)團消退、病情暫時控制C組較健康對照D組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達均顯著上調(diào),這與Gentinetta等[10]、Yasnowsky等[11]研究結(jié)果一致,說明無論風(fēng)團是否存在,活化的嗜堿粒細胞均參與疾病的過程。國內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)嗜堿粒細胞在慢性蕁麻疹患者顯著高于急性蕁麻疹患者[12],亦有研究得出相反的結(jié)論[13]。嗜堿粒細胞在CSU風(fēng)團形成過程中的作用機制與環(huán)節(jié)尚不明確,本組研究還比較了風(fēng)團存在的A、B兩組與風(fēng)團暫時控制的C組嗜堿粒細胞CD63和CD203c的表達情況,結(jié)果顯示A、B組兩組與C組之間并無明顯差異,提示活化的嗜堿粒細胞參與了具有炎癥反應(yīng)的風(fēng)團形成過程。嗜堿粒細胞在慢性過敏性炎癥反應(yīng)中起著引發(fā)劑的作用,而并非單一效應(yīng)物。嗜堿粒細胞浸潤CSU患者的皮損中[14],但嗜堿粒細胞的活化與風(fēng)團持續(xù)時間無明顯相關(guān)。在CSU的發(fā)病過程中,除了嗜堿粒細胞,還有其它因素使風(fēng)團持續(xù)存在,如肥大細胞和自身免疫抗體等。本實驗結(jié)果說明了活化的嗜堿粒細胞可能參與了風(fēng)團的形成、發(fā)展,在風(fēng)團消退病情暫時控制階段嗜堿粒細胞也起到一定的作用,這為臨床治療CSU時抗炎藥物選擇的時機提供了幫助。

        CSU發(fā)病機制復(fù)雜,本研究進一步提示,活化的嗜堿粒細胞參與了CSU的發(fā)病過程,但與風(fēng)團持續(xù)時間長短無明顯差異。由于本研究樣本量較小,這一結(jié)果有待進一步證實。

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