孔 偉 曹艷云 曹秀妮 徐 徉 蔡海斌 徐順明

慢性自發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticarial, CSU)是指不論病因是否清楚，不依賴于任何外源性物理刺激，由內(nèi)源性因素引起的慢性蕁麻疹[1]。嗜堿粒細胞和肥大細胞與CSU的發(fā)病機制相關(guān)，雖然嗜堿粒細胞占體內(nèi)白細胞的比例不到1%，但它是IgG介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的主要參與者之一，且能募集促炎細胞，如嗜酸粒細胞和中性粒細胞[2]。此外，嗜堿粒細胞有多種表面標志物表達，其中CD63和CD203c是判斷嗜堿粒細胞活化和分化最有效的標志物[3,4]。

我們采用流式細胞術(shù)檢測風團持續(xù)不同時間以及治療后風團消退、病情暫時控制的CSU患者外周血中嗜堿粒細胞CD63和CD203c的表達水平，評估嗜堿粒細胞在風團不同狀態(tài)下的活化情況，探討外周血嗜堿粒細胞活化在CSU發(fā)病機制中的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 隨機選擇本科室2017年12月至2018年12月前來就診的CSU患者。病例入選標準：(1)18～65歲；(2)風團單個皮損持續(xù)時間<24 h，反復(fù)發(fā)作6周以上，每周至少發(fā)作2次；(3)無過敏性鼻炎，哮喘，特異性皮炎等過敏性疾病病史；無寄生蟲感染及自身免疫性疾病病史；(4)符合慢性自發(fā)性蕁麻疹診斷標準。排除標準：(1)妊娠及哺乳期婦女；(2)遺傳性血管性水腫、慢性可誘導(dǎo)性蕁麻疹和其他類型慢性蕁麻疹；(3)過去3天內(nèi)使用過抗組胺藥物，過去4周內(nèi)已使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、止血或抗凝血藥；(4)合并皮炎、濕疹等引起瘙癢的皮膚病。(5)嚴重的系統(tǒng)性疾病，包括心臟病、嚴重肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病，慢性感染、精神病、惡性腫瘤、高血壓、糖尿病、吸毒和酗酒患者等。本研究通過我院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有患者及健康對照均簽署知情同意書。評分標準[1]：患者入組，填寫臨床調(diào)查表，了解治療前的風團情況與風團持續(xù)時間、瘙癢癥狀、并進行量化評分。按下列兩項進行評價：評分相加即為總評分。(1)風團數(shù)目：0分為無風團；1分為風團數(shù)<20個/24 h；2分為風團數(shù)20～50個/24 h；3分為風團數(shù)>50個/24 h，或有大面積風團。(2)瘙癢程度：0分為無瘙癢；1分為輕度瘙癢；2分為中度瘙癢，但不影響日常生活和睡眠；3分為重度瘙癢，不能忍受，嚴重困擾日常生活和睡眠。治療方案選擇：選用一種或兩種新一代抗組胺藥物依巴斯汀片(10 mg，1/日，口服)和/或左西替利嗪膠囊(5 mg，1/晚，口服)，如經(jīng)治療4周皮疹仍未控制者，納入剔除范圍。

1.1.2 分組方法 共選取符合研究要求的CSU患者45例。按風團持續(xù)時間與治療情況納入A、B、C三組。

A組：風團在2 h內(nèi)自行消退者15例，其中男性5例，女性10例，平均年齡(38.38±11.05)歲(22～61歲)。風團未消退時采集血樣。B組：風團持續(xù)12～24 h自行消退者15例，其中男性6例，女性9例，平均年齡(40.64±13.09)歲(21～61歲)。風團未消退時采集血樣。C組：經(jīng)治療后風團消退持續(xù)一周未復(fù)發(fā)者15例，其中男性6例，女性9例，平均年齡(32.83±13.07)歲(20～61歲)。D組：健康對照組，為門診體檢血常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂正常，既往無過敏性及系統(tǒng)性疾病健康者。15例，其中男性8例，女性7例，平均年齡(40.69±11.19)歲(22～58歲)。

1.2 主要試劑與儀器 熒光標記單克隆抗體：美國BECKMAN COULTER公司Anti-HLA-DR-PC5、CD123-ECD、CD63-FITC、CD 203c-PE ，流式細胞儀為美國BECKMAN COULTER NAVIOS流式細胞分析系統(tǒng)。

1.3 樣本采集與測定

1.3.1 所有患者和健康對照者各抽血5 mL，靜置后4000 r/min(r=10 cm)離心5 min，留取上清，及時檢測。

1.3.2 標本處理分別向已編好號的試管中加入10 μL單克隆抗體；分別向試管中加入混勻的100 μL抗凝血；混勻，避光，室溫孵育20～30 min；加入溶血劑500 μL，避光15 min；上機測樣。

1.3.3 檢測及分析 每次檢測前均用Flow.Check熒光微球(Beckman Coulter)校準儀器，標本上機后，先以前向角散射光和側(cè)向角散射光參數(shù)大致觀察細胞形態(tài)，選取有核細胞，排除細胞碎片和雜質(zhì)。選取CD123陽性而HLA-DR陰性的細胞即為嗜堿粒細胞，用CD63和CD203c雙參數(shù)進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件處理，數(shù)據(jù)資料以(均數(shù)±標準誤)表示，不同組間進行t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FCM圖表現(xiàn) 先選取CD123+HLA-DR-的外周血嗜堿粒細胞，再選取CD63+CD203c+活化的嗜堿粒細胞，結(jié)果表明A、B、C三組較D組嗜堿粒細胞CD63+CD203c+的熒光強度增加，陽性率增高。見圖1。

2.2 四組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達情況 結(jié)果顯示：與D組相比，A、B、C三組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達均顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A、B、C三組兩兩之間比較無顯著差異(P>0.05)；具體結(jié)果見表1。

表1 CSU患者與健康對照組嗜堿粒細胞CD63+CD203c+表達情況

注：*A、B、C三組分別與健康對照D組比較，均P<0.05，有統(tǒng)計學意義；A、B、C三組間比較P>0.05，無統(tǒng)計學意義

圖1流式細胞儀檢測四組嗜堿粒細胞CD63和CD203c活化率

2.3 各組之間嗜堿粒細胞活化率情況，結(jié)果表明A、B、C組活化率明顯高于D組，見圖2。

圖2 各組嗜堿粒細胞CD63和CD203c活化百分率散點圖

3 討論

CSU是一種全身性的炎癥過敏性疾病，由于病因和發(fā)病機制不盡相同，風團持續(xù)時間也各不相同。部分患者風團持續(xù)<2 h能自行消退，也有患者風團持續(xù)12～24 h方可消退。在CSU，風團持續(xù)時間與患者生活質(zhì)量密切相關(guān)，目前對于風團持續(xù)時間無明確劃分標準，有分為<2 h和超過2 h者，以及<24 h和超過24 h者[5]。我們前期曾使用iTRAQ技術(shù)鑒定和驗證了風團持續(xù)時間不同的CSU患者血清中差異表達的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)風團持續(xù)12～24 h組較<2 h組差異蛋白顯著[6]，因此本研究沿用前期使用的標準，以風團持續(xù)時間<2 h、12～24 h和治療后風團有效控制的CSU患者進行分組。

嗜堿粒細胞在慢性過敏性皮膚病中發(fā)揮著重要作用，與肥大細胞一樣，也是CSU的主要靶細胞[7]。嗜堿粒細胞有多種表面標志物，CD63和CD203c作為嗜堿粒細胞的主要激活標記物[8]，基于其表達代表胞內(nèi)兩種不同的活化信號通路，且分別反映釋放組胺的不同方式，因此利用流式細胞術(shù)聯(lián)合檢測胞膜CD63、CD203c可全面評估CSU患者嗜堿粒細胞活化情況。

既往研究表明，在CSU，外周血嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達增加[9]，但表達水平與風團持續(xù)時間以及病情活動之間的關(guān)聯(lián)尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，CSU風團持續(xù)時間不同的A、B兩組和風團消退、病情暫時控制C組較健康對照D組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達均顯著上調(diào)，這與Gentinetta等[10]、Yasnowsky等[11]研究結(jié)果一致，說明無論風團是否存在，活化的嗜堿粒細胞均參與疾病的過程。國內(nèi)有學者發(fā)現(xiàn)嗜堿粒細胞在慢性蕁麻疹患者顯著高于急性蕁麻疹患者[12]，亦有研究得出相反的結(jié)論[13]。嗜堿粒細胞在CSU風團形成過程中的作用機制與環(huán)節(jié)尚不明確，本組研究還比較了風團存在的A、B兩組與風團暫時控制的C組嗜堿粒細胞CD63和CD203c的表達情況，結(jié)果顯示A、B組兩組與C組之間并無明顯差異，提示活化的嗜堿粒細胞參與了具有炎癥反應(yīng)的風團形成過程。嗜堿粒細胞在慢性過敏性炎癥反應(yīng)中起著引發(fā)劑的作用，而并非單一效應(yīng)物。嗜堿粒細胞浸潤CSU患者的皮損中[14]，但嗜堿粒細胞的活化與風團持續(xù)時間無明顯相關(guān)。在CSU的發(fā)病過程中，除了嗜堿粒細胞，還有其它因素使風團持續(xù)存在，如肥大細胞和自身免疫抗體等。本實驗結(jié)果說明了活化的嗜堿粒細胞可能參與了風團的形成、發(fā)展，在風團消退病情暫時控制階段嗜堿粒細胞也起到一定的作用，這為臨床治療CSU時抗炎藥物選擇的時機提供了幫助。

CSU發(fā)病機制復(fù)雜，本研究進一步提示，活化的嗜堿粒細胞參與了CSU的發(fā)病過程，但與風團持續(xù)時間長短無明顯差異。由于本研究樣本量較小，這一結(jié)果有待進一步證實。