梁曉涵 黨 政 楊雅雅 王 丹

(1海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 海南?？?70314；2海南省食品藥品檢驗(yàn)所儋州分所 海南儋州571700)

雙甲脒是一種廣譜性甲脒類殺蟲(chóng)殺螨劑，具有多種毒殺機(jī)制，主要用于果樹(shù)、蔬菜、茶葉、棉花、大豆等作物的除螨，對(duì)部分鱗翅目類害蟲(chóng)卵有效，還可用于牛羊等牲畜防治蜱螨。雙甲脒對(duì)人、畜有一定的毒性，對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)能產(chǎn)生抑制作用，中毒后無(wú)特效藥物，其主要水解代謝產(chǎn)物2，4-二甲基苯胺具有高毒性，對(duì)人體有致癌、致突變等多種潛在危害［1-2］。因此，澳大利亞、日本、韓國(guó)等國(guó)家和地區(qū)對(duì)食品中的雙甲脒殘留限量做了嚴(yán)格的規(guī)定，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［3］也規(guī)定了食品中雙甲脒的最大殘留限量：0.05～0.5 mg/kg，為雙甲脒及N-（2，4-二甲苯基）-N′-甲基甲脒之和，以雙甲脒表示。

目前，常用的雙甲脒的檢測(cè)分析方法氣相色譜 法［4-7］、氣質(zhì)聯(lián)用法［8-13］、液相色譜法［14］和液質(zhì)聯(lián)用法［15-16］，現(xiàn)行果蔬中雙甲脒的測(cè)定使用GB/T 5009.143-2003國(guó)標(biāo)法，然而該標(biāo)準(zhǔn)采用填充柱進(jìn)行色譜分離、前處理需回流裝置水解、水解產(chǎn)物還得衍生化后再測(cè)定，方法嚴(yán)重滯后給現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作帶來(lái)諸多不便和困擾。已報(bào)道的雙甲脒測(cè)定方法原理大致相同，經(jīng)酸或堿水解后測(cè)定其水解終產(chǎn)物，換算成雙甲脒含量計(jì)。近年來(lái)，未見(jiàn)有針對(duì)果蔬中雙甲脒氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定的研究報(bào)道。因此，建立更科學(xué)、便捷、廣泛適用的檢測(cè)果蔬中雙甲脒總殘留量的分析方法具有重要意義。本研究采用雙甲脒測(cè)定的主流氣質(zhì)法，對(duì)果蔬中雙甲脒及其代謝物測(cè)定的前處理進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)水解方式和產(chǎn)物、水解條件及效率、基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇等方面進(jìn)行探討，驗(yàn)證該方法的可靠性及準(zhǔn)確性，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行大批量檢驗(yàn)，獲得良好的效果。本研究結(jié)果對(duì)果蔬中雙甲脒及其代謝物殘留量的檢測(cè)提供了可行的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

7890B/7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent，美國(guó)）；ProBlend 6攪拌機(jī)（Philips，德國(guó)）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多，瑞士）；50 mL聚四氟乙烯微波消解罐（LabTech，北京）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器，中國(guó)）；Multi Reax全能型渦旋振蕩器（Heidolph，德國(guó)）；Centrifuge 5804 R離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（默克-密理博，德國(guó)）。

1.1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

濃鹽酸（GR，廣州化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（AR，阿拉?。?；水為超純水；丙酮（色譜純，Merck KGaA）；正己烷（色譜純，Merck KGaA）；雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer，純度 99.8%，CAS：33089-61-1，批號(hào) G128883）；2，4-二甲苯胺標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer，純度99.3%，CAS：95-68-1，批號(hào)G131417）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

鹽酸溶液（1 mol/L）：量取86 mL濃鹽酸，用超純水溶解并稀釋至1 L。氫氧化鈉溶液（2 mol/L）：稱取80 g氫氧化鈉，用超純水溶解并稀釋至1 L。雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱取0.010 0 g的雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮定容于10.0 mL容量瓶，得1.00 mg/mL雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（置于-18℃以下保存，可穩(wěn)定6個(gè)月），再根據(jù)需要，臨用前用丙酮稀釋。2，4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱取0.010 0 g的2，4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮定容于10.0 mL容量瓶，得1.00 mg/mL 2，4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（置于-18℃以下保存，可穩(wěn)定6個(gè)月），再根據(jù)需要，臨用前用丙酮稀釋。

1.2.2 色譜條件

氣相色譜條件：DB-1MS色譜柱（30 m×0.250 mm×0.25 μm，內(nèi)層涂以100%聚二甲基硅氧烷）；進(jìn)樣口溫度：230℃，不分流進(jìn)樣；MSD傳輸線溫度：280℃；載氣：氦氣，柱流速：2.0 mL/min；程序升溫：初溫60℃，保持3 min，以25℃/min升至280℃，保持5 min；進(jìn)樣量：1.0μL；

質(zhì)譜條件：EI源；電子能量：70eV；離子源溫度：300℃；四級(jí)桿MS1溫度：180℃；四級(jí)桿MS2溫度：180℃；碰撞氣：氮?dú)?；采集方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；監(jiān)測(cè)的特征離子對(duì)2，4-二甲基苯胺MRM條件參數(shù)為定量離子對(duì) （碰撞能量）121＞106（10） M/Z（eV），輔助定性離子對(duì)（碰撞能量）120＞77（10）M/Z（eV），輔助定性離子對(duì)（碰撞能量）106＞77（20）M/Z（eV）；保留時(shí)間（RT）：（6.31±0.1）min。

1.2.3 測(cè)定方法

試樣前處理：取代表性果蔬樣品約1.0 kg，切碎混勻攪拌機(jī)攪碎制成勻漿。

試樣制備：準(zhǔn)確稱取果蔬勻漿試樣10.00 g于50 mL聚四氟乙烯微波消解罐中，加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液，混勻，于電熱鼓風(fēng)干燥箱中120℃靜置水解30 min，水浴冷卻后，加入10 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入5 mL正己烷，于2 000 r/min高速渦旋振搖5 min，液液萃取，后以8 000 r/min離心5 min，收集有機(jī)相至10 mL容量瓶，下層水相再加5 mL正己烷萃取一次，合并有機(jī)相并用正己烷定容，待上機(jī)。

雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的制備：取1.00 mg/mL雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用丙酮稀釋至50.0μg/mL，再用超純水分別配制成濃度為5、20、50、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，分別準(zhǔn)確吸取10.0 mL于50 mL聚四氟乙烯微波消解罐中，加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液，混勻，于電熱鼓風(fēng)干燥箱中120℃靜置水解30 min，水浴冷卻后，加入10 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入5 mL正己烷，于2 000 r/min高速渦旋振搖5 min，液液萃取，后以8 000 r/min離心5 min，收集有機(jī)相至10 mL容量瓶，下層水相再加5 mL正己烷萃取1次，合并有機(jī)相并用正己烷定容，得同上濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別進(jìn)樣1.0μL于GC-MS/MS中分析，以定量離子對(duì)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試樣測(cè)定：進(jìn)樣1.0 μL于GC-MS/MS中分析，測(cè)得其響應(yīng)值，根據(jù)保留時(shí)間、所選監(jiān)測(cè)離子對(duì)和離子對(duì)豐度比定性，用外標(biāo)法定量樣品處理液中2，4-二甲基苯胺含量，即相當(dāng)于樣品處理液中雙甲脒含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的確定

2.1.1 譜圖

2，4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM總離子流圖及選擇監(jiān)測(cè)離子色譜圖和質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1、圖2和圖3。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在本試驗(yàn)條件下，雙甲脒水解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在5～2 000 ng/mL范圍內(nèi)其響應(yīng)與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=7 189.809 3x-137.620 0，相關(guān)系數(shù)γ為0.999 4，檢出限為0.005 0 mg/kg。

2.1.3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在6種果蔬樣品空白中，分別加入表1所示濃度的雙甲脒，按本文方法處理，每個(gè)添加濃度分別測(cè)定6次，得到加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。結(jié)果表明：雙甲脒在6種果蔬樣品中的加標(biāo)回收率均值為 70.4%～92.9%，RSD為 1.87%～6.55%（表1），本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。辣椒樣品空白和其樣品空白加標(biāo)的總離子流圖見(jiàn)圖4和5，茄子樣品空白和其樣品空白加標(biāo)的總離子流圖見(jiàn)圖6和7。

圖1 2，4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖（TIC）

圖4 辣椒樣品空白總離子流圖（TIC）

圖5 辣椒樣品空白加標(biāo)總離子流圖（TIC）

圖6 茄子樣品空白總離子流圖（TIC）

圖7 茄子樣品空白加標(biāo)總離子流圖（TIC）

表1 6種果蔬樣品的加標(biāo)回收率均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.1.4 樣品測(cè)定結(jié)果

采用該方法對(duì)市場(chǎng)監(jiān)督抽查的3批次共105份果蔬樣品，包括32份番茄、26份黃瓜、19份茄子、15份辣椒、購(gòu)自超市的13份蘋(píng)果、梨等樣品按建立的方法進(jìn)行測(cè)定，雙甲脒檢出濃度范圍在0.01～0.16 mg/kg，檢出率為11%，樣品中雙甲脒殘留量均未超國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限值［3］（蔬菜和水果中最大殘留限量為0.5 mg/kg）。

2.2 測(cè)定條件的優(yōu)化分析

2.2.1 水解條件的選擇和優(yōu)化

試驗(yàn)對(duì)兩組水解反應(yīng)程度進(jìn)行了比較，以期得到最優(yōu)化的水解條件。

第一組，酸水解與堿水解介質(zhì)的選擇，實(shí)驗(yàn)對(duì)比見(jiàn)表2，水解處理液經(jīng)全掃SCAN模式，檢索NIST MS庫(kù)匹配化合物質(zhì)譜圖確證水解產(chǎn)物種類。結(jié)果表明：在酸或堿濃度及雙甲脒濃度、水解時(shí)間一致，只改變水解溫度條件下，酸水解比堿水解速率高、效果好；水解溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，水解進(jìn)程越徹底，但溫度過(guò)高，水解產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步消解。

表2 水解介質(zhì)的選擇

第二組，在雙甲脒標(biāo)液濃度均為1.0μg/mL、水解溫度為120℃條件下，加入不同濃度的鹽酸溶液，轉(zhuǎn)化率見(jiàn)圖8。結(jié)果表明：酸濃度適當(dāng)增大，水解加劇，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率不斷增大，30 min后基本達(dá)到平衡，水解基本完全，HCl介質(zhì)為1 mol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率保持在95%～99%，但酸濃度過(guò)大，水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)造成水解終產(chǎn)物進(jìn)一步消解。故本文選擇最佳水解條件為加1 mol/L HCl，于電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱中120℃放置30 min。

2.2.2 基質(zhì)效應(yīng)的影響分析

質(zhì)譜法農(nóng)殘檢測(cè)通常會(huì)考慮基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的影響，對(duì)樣品空白處理液采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)分析，分別取辣椒、黃瓜、茄子、西紅柿、梨、蘋(píng)果6種果蔬樣品空白基質(zhì)溶液各1.0 mL，準(zhǔn)確加入50.0 μg/mL 2，4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液各20.0 μL，與同濃度1.0 μg/mL 2，4-二甲基苯胺正己烷溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定峰面積響應(yīng)值比較（表3），得到基質(zhì)標(biāo)液響應(yīng)值與純?nèi)軇?biāo)液響應(yīng)值的比值為93.1%～113.0%。測(cè)定結(jié)果表明樣品處理液基質(zhì)效應(yīng)微乎其微，不存在明顯的基質(zhì)增益或抑制現(xiàn)象。

圖8 酸濃度與水解時(shí)間對(duì)水解轉(zhuǎn)化率的影響

表3 2，4-二甲基苯胺在純?nèi)軇┡c基質(zhì)溶液中的測(cè)定響應(yīng)比較

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 檢測(cè)器的選擇

雙甲脒及代謝物N-（2，4-二甲苯基）-N′-甲基甲脒即單甲脒在氣相GC-ECD上基本無(wú)響應(yīng)，其水解產(chǎn)物2，4-二甲基苯胺在ECD檢測(cè)器上響應(yīng)很小，檢出限高，且樣品雜峰的干擾容易導(dǎo)致假陽(yáng)性判斷。而2，4-二甲基苯胺經(jīng)七氟丁酸酐衍生生成2，4-二甲基苯七氟丁酸胺后雖在ECD檢測(cè)器上有強(qiáng)響應(yīng)，抗基質(zhì)干擾效果顯著，但七氟丁酸酐衍生反應(yīng)進(jìn)行緩慢，需后續(xù)處理，操作繁瑣耗時(shí)，加之七氟丁酸酐高毒，會(huì)引發(fā)急性毒性，對(duì)操作者安全健康很不利。因此，本研究樣品水解液堿化后經(jīng)正己烷液液萃取，再采用GC-MS/MS直接分析2，4-二甲基苯胺，避免進(jìn)一步凈化造成的目標(biāo)物損失，以保留時(shí)間和質(zhì)譜雙重定性，選擇監(jiān)測(cè)離子對(duì)定量，可靠性也更高、抗干擾力更強(qiáng)，能很好的減小雜質(zhì)干擾帶來(lái)的影響，對(duì)于種類多樣、多色素、多糖、含多種有機(jī)酸等復(fù)雜基質(zhì)的果蔬樣品非常適合，本底低、噪音小，靈敏度也更高。

3.1.2 水解產(chǎn)物的分析

雙甲脒及代謝物單甲脒農(nóng)殘的檢測(cè)不直接測(cè)其本體，是因?yàn)殡p甲脒易發(fā)生水解反應(yīng)，在自然環(huán)境下會(huì)緩慢水解為單甲脒，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，單甲脒又進(jìn)一步水解為2，4-二甲基苯基甲酰胺、2，4-二甲基苯胺，還有小分子的甲胺、甲酸［17］等。其水解可在酸或堿條件的催化下加速進(jìn)行，水解速率與酸堿液的濃度相關(guān)，濃度越大，水解越快。水解分步進(jìn)行，終產(chǎn)物一致［15-17］，所以若雙甲脒水解進(jìn)行不完全，會(huì)產(chǎn)生以上多種中間產(chǎn)物，導(dǎo)致終產(chǎn)物2，4-二甲基苯胺轉(zhuǎn)化率不高、回收不理想。因此使其水解轉(zhuǎn)化徹底，再以2，4-二甲基苯胺含量換算雙甲脒含量，方法科學(xué)、準(zhǔn)確。

3.1.3 水解方式的選擇

雙甲脒及其代謝物的水解可用微波消解罐在電熱鼓風(fēng)干燥箱中恒溫進(jìn)行，罐中高溫高壓使得水解反應(yīng)速率呈倍增長(zhǎng)，加快水解進(jìn)程、縮短水解時(shí)間、促進(jìn)反應(yīng)徹底，較之文獻(xiàn)方法采用的低溫水解及國(guó)標(biāo)法采用的回流水解，優(yōu)勢(shì)明顯：可實(shí)現(xiàn)水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化完全，多樣品同時(shí)進(jìn)行前處理，還省去了回流、冷凝裝置的安裝過(guò)程，極大的簡(jiǎn)化操作流程、提高工作時(shí)效、省時(shí)、省力、省空間。

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇

采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，配制一組濃度呈梯度的雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品同時(shí)進(jìn)行前處理（經(jīng)水解、萃?。┖螅玫玫降臉?biāo)準(zhǔn)溶液處理液上機(jī)測(cè)定，由于多種樣品的基質(zhì)干擾效應(yīng)并不明顯，無(wú)需加入基質(zhì)溶液，即得系列2，4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用外標(biāo)法定量計(jì)算。對(duì)比用純?nèi)軇┲苯优渲频?，4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，省去換算2，4-二甲基苯胺與雙甲脒分子量之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)，還可消除水解萃取過(guò)程其回收率損失，使加標(biāo)回收更合理、有效反映測(cè)定的準(zhǔn)確性，確保分析結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

3.2 結(jié)論

已報(bào)道的文獻(xiàn)資料方法對(duì)食品中雙甲脒及其代謝物單甲脒的測(cè)定主要分兩類：一類是不經(jīng)水解，直接測(cè)定其樣品中雙甲脒或者雙甲脒和2，4-二甲基苯胺的含量，以雙甲脒計(jì)。此類方法未經(jīng)水解轉(zhuǎn)化，又忽略其它水解產(chǎn)物的含量，會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏小。第二類是樣品經(jīng)水解處理，再測(cè)定其水解終產(chǎn)物2，4-二甲基苯胺的含量，后換算成雙甲脒含量，以雙甲脒計(jì)。國(guó)標(biāo)法［7-8］水解反應(yīng)在強(qiáng)酸介質(zhì)120℃水浴條件下回流2 h，卻有文獻(xiàn)報(bào)道的水解反應(yīng)只于離心管內(nèi)在60～70℃恒溫干燥箱中靜置 30～50 min進(jìn)行［5-6，11］，很顯然這些文獻(xiàn)檢測(cè)方法的反應(yīng)溫度、壓力、時(shí)間等設(shè)計(jì)不能滿足水解反應(yīng)的條件要求，從而水解進(jìn)行不完全，會(huì)造成測(cè)定含量偏小，測(cè)定不準(zhǔn)確。本文引入用微波消解罐于高溫高壓方式替代繁瑣的水浴回流方式進(jìn)行水解反應(yīng)，應(yīng)用于雙甲脒及其代謝物的測(cè)定，提高水解反應(yīng)速率、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)高效。

綜上所述，本文用GC-MS/MS法對(duì)果蔬中雙甲脒及其代謝物殘留量的測(cè)定進(jìn)行研究和優(yōu)化，建立了用消解罐法進(jìn)行雙甲脒水解反應(yīng)的前處理方法，果蔬中雙甲脒在微波消解罐中酸催化水解得2，4-二甲基苯胺，經(jīng)過(guò)量堿液中和堿化，正己烷液液萃取，以外標(biāo)法定量計(jì)算得雙甲脒總殘留量。本方法的線性關(guān)系良好，靈敏度、精密度、回收率等均能滿足果蔬樣品農(nóng)殘的檢測(cè)要求，并簡(jiǎn)化前處理流程，為快速、準(zhǔn)確、批量的進(jìn)行果蔬樣品中雙甲脒總殘留量的檢測(cè)工作提供了參考。