梁曉涵 黨 政 楊雅雅 王 丹
(1海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 海南???70314;2海南省食品藥品檢驗(yàn)所儋州分所 海南儋州571700)
雙甲脒是一種廣譜性甲脒類殺蟲(chóng)殺螨劑,具有多種毒殺機(jī)制,主要用于果樹(shù)、蔬菜、茶葉、棉花、大豆等作物的除螨,對(duì)部分鱗翅目類害蟲(chóng)卵有效,還可用于牛羊等牲畜防治蜱螨。雙甲脒對(duì)人、畜有一定的毒性,對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)能產(chǎn)生抑制作用,中毒后無(wú)特效藥物,其主要水解代謝產(chǎn)物2,4-二甲基苯胺具有高毒性,對(duì)人體有致癌、致突變等多種潛在危害[1-2]。因此,澳大利亞、日本、韓國(guó)等國(guó)家和地區(qū)對(duì)食品中的雙甲脒殘留限量做了嚴(yán)格的規(guī)定,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[3]也規(guī)定了食品中雙甲脒的最大殘留限量:0.05~0.5 mg/kg,為雙甲脒及N-(2,4-二甲苯基)-N′-甲基甲脒之和,以雙甲脒表示。
目前,常用的雙甲脒的檢測(cè)分析方法氣相色譜 法[4-7]、氣質(zhì)聯(lián)用法[8-13]、液相色譜法[14]和液質(zhì)聯(lián)用法[15-16],現(xiàn)行果蔬中雙甲脒的測(cè)定使用GB/T 5009.143-2003國(guó)標(biāo)法,然而該標(biāo)準(zhǔn)采用填充柱進(jìn)行色譜分離、前處理需回流裝置水解、水解產(chǎn)物還得衍生化后再測(cè)定,方法嚴(yán)重滯后給現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作帶來(lái)諸多不便和困擾。已報(bào)道的雙甲脒測(cè)定方法原理大致相同,經(jīng)酸或堿水解后測(cè)定其水解終產(chǎn)物,換算成雙甲脒含量計(jì)。近年來(lái),未見(jiàn)有針對(duì)果蔬中雙甲脒氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定的研究報(bào)道。因此,建立更科學(xué)、便捷、廣泛適用的檢測(cè)果蔬中雙甲脒總殘留量的分析方法具有重要意義。本研究采用雙甲脒測(cè)定的主流氣質(zhì)法,對(duì)果蔬中雙甲脒及其代謝物測(cè)定的前處理進(jìn)行了優(yōu)化,對(duì)水解方式和產(chǎn)物、水解條件及效率、基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇等方面進(jìn)行探討,驗(yàn)證該方法的可靠性及準(zhǔn)確性,并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行大批量檢驗(yàn),獲得良好的效果。本研究結(jié)果對(duì)果蔬中雙甲脒及其代謝物殘留量的檢測(cè)提供了可行的依據(jù)。
1.1.1 儀器
7890B/7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent,美國(guó));ProBlend 6攪拌機(jī)(Philips,德國(guó));AL204-IC電子天平(梅特勒-托利多,瑞士);50 mL聚四氟乙烯微波消解罐(LabTech,北京);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器,中國(guó));Multi Reax全能型渦旋振蕩器(Heidolph,德國(guó));Centrifuge 5804 R離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó));Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(默克-密理博,德國(guó))。
1.1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
濃鹽酸(GR,廣州化學(xué)試劑廠);氫氧化鈉(AR,阿拉?。?;水為超純水;丙酮(色譜純,Merck KGaA);正己烷(色譜純,Merck KGaA);雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer,純度 99.8%,CAS:33089-61-1,批號(hào) G128883);2,4-二甲苯胺標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer,純度99.3%,CAS:95-68-1,批號(hào)G131417)。
1.2.1 溶液的配制
鹽酸溶液(1 mol/L):量取86 mL濃鹽酸,用超純水溶解并稀釋至1 L。氫氧化鈉溶液(2 mol/L):稱取80 g氫氧化鈉,用超純水溶解并稀釋至1 L。雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:精確稱取0.010 0 g的雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)品,用丙酮定容于10.0 mL容量瓶,得1.00 mg/mL雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(置于-18℃以下保存,可穩(wěn)定6個(gè)月),再根據(jù)需要,臨用前用丙酮稀釋。2,4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:精確稱取0.010 0 g的2,4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)品,用丙酮定容于10.0 mL容量瓶,得1.00 mg/mL 2,4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(置于-18℃以下保存,可穩(wěn)定6個(gè)月),再根據(jù)需要,臨用前用丙酮稀釋。
1.2.2 色譜條件
氣相色譜條件:DB-1MS色譜柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm,內(nèi)層涂以100%聚二甲基硅氧烷);進(jìn)樣口溫度:230℃,不分流進(jìn)樣;MSD傳輸線溫度:280℃;載氣:氦氣,柱流速:2.0 mL/min;程序升溫:初溫60℃,保持3 min,以25℃/min升至280℃,保持5 min;進(jìn)樣量:1.0μL;
質(zhì)譜條件:EI源;電子能量:70eV;離子源溫度:300℃;四級(jí)桿MS1溫度:180℃;四級(jí)桿MS2溫度:180℃;碰撞氣:氮?dú)?;采集方式:多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;監(jiān)測(cè)的特征離子對(duì)2,4-二甲基苯胺MRM條件參數(shù)為定量離子對(duì) (碰撞能量)121>106(10) M/Z(eV),輔助定性離子對(duì)(碰撞能量)120>77(10)M/Z(eV),輔助定性離子對(duì)(碰撞能量)106>77(20)M/Z(eV);保留時(shí)間(RT):(6.31±0.1)min。
1.2.3 測(cè)定方法
試樣前處理:取代表性果蔬樣品約1.0 kg,切碎混勻攪拌機(jī)攪碎制成勻漿。
試樣制備:準(zhǔn)確稱取果蔬勻漿試樣10.00 g于50 mL聚四氟乙烯微波消解罐中,加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液,混勻,于電熱鼓風(fēng)干燥箱中120℃靜置水解30 min,水浴冷卻后,加入10 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液,混勻,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管,加入5 mL正己烷,于2 000 r/min高速渦旋振搖5 min,液液萃取,后以8 000 r/min離心5 min,收集有機(jī)相至10 mL容量瓶,下層水相再加5 mL正己烷萃取一次,合并有機(jī)相并用正己烷定容,待上機(jī)。
雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的制備:取1.00 mg/mL雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用丙酮稀釋至50.0μg/mL,再用超純水分別配制成濃度為5、20、50、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中,分別準(zhǔn)確吸取10.0 mL于50 mL聚四氟乙烯微波消解罐中,加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液,混勻,于電熱鼓風(fēng)干燥箱中120℃靜置水解30 min,水浴冷卻后,加入10 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液,混勻,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管,加入5 mL正己烷,于2 000 r/min高速渦旋振搖5 min,液液萃取,后以8 000 r/min離心5 min,收集有機(jī)相至10 mL容量瓶,下層水相再加5 mL正己烷萃取1次,合并有機(jī)相并用正己烷定容,得同上濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,分別進(jìn)樣1.0μL于GC-MS/MS中分析,以定量離子對(duì)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
試樣測(cè)定:進(jìn)樣1.0 μL于GC-MS/MS中分析,測(cè)得其響應(yīng)值,根據(jù)保留時(shí)間、所選監(jiān)測(cè)離子對(duì)和離子對(duì)豐度比定性,用外標(biāo)法定量樣品處理液中2,4-二甲基苯胺含量,即相當(dāng)于樣品處理液中雙甲脒含量。
2.1.1 譜圖
2,4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM總離子流圖及選擇監(jiān)測(cè)離子色譜圖和質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1、圖2和圖3。
2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限
在本試驗(yàn)條件下,雙甲脒水解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在5~2 000 ng/mL范圍內(nèi)其響應(yīng)與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,其回歸方程為y=7 189.809 3x-137.620 0,相關(guān)系數(shù)γ為0.999 4,檢出限為0.005 0 mg/kg。
2.1.3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
在6種果蔬樣品空白中,分別加入表1所示濃度的雙甲脒,按本文方法處理,每個(gè)添加濃度分別測(cè)定6次,得到加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。結(jié)果表明:雙甲脒在6種果蔬樣品中的加標(biāo)回收率均值為 70.4%~92.9%,RSD為 1.87%~6.55%(表1),本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。辣椒樣品空白和其樣品空白加標(biāo)的總離子流圖見(jiàn)圖4和5,茄子樣品空白和其樣品空白加標(biāo)的總離子流圖見(jiàn)圖6和7。
圖1 2,4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖(TIC)
圖4 辣椒樣品空白總離子流圖(TIC)
圖5 辣椒樣品空白加標(biāo)總離子流圖(TIC)
圖6 茄子樣品空白總離子流圖(TIC)
圖7 茄子樣品空白加標(biāo)總離子流圖(TIC)
表1 6種果蔬樣品的加標(biāo)回收率均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
2.1.4 樣品測(cè)定結(jié)果
采用該方法對(duì)市場(chǎng)監(jiān)督抽查的3批次共105份果蔬樣品,包括32份番茄、26份黃瓜、19份茄子、15份辣椒、購(gòu)自超市的13份蘋(píng)果、梨等樣品按建立的方法進(jìn)行測(cè)定,雙甲脒檢出濃度范圍在0.01~0.16 mg/kg,檢出率為11%,樣品中雙甲脒殘留量均未超國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限值[3](蔬菜和水果中最大殘留限量為0.5 mg/kg)。
2.2.1 水解條件的選擇和優(yōu)化
試驗(yàn)對(duì)兩組水解反應(yīng)程度進(jìn)行了比較,以期得到最優(yōu)化的水解條件。
第一組,酸水解與堿水解介質(zhì)的選擇,實(shí)驗(yàn)對(duì)比見(jiàn)表2,水解處理液經(jīng)全掃SCAN模式,檢索NIST MS庫(kù)匹配化合物質(zhì)譜圖確證水解產(chǎn)物種類。結(jié)果表明:在酸或堿濃度及雙甲脒濃度、水解時(shí)間一致,只改變水解溫度條件下,酸水解比堿水解速率高、效果好;水解溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng),水解進(jìn)程越徹底,但溫度過(guò)高,水解產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步消解。
表2 水解介質(zhì)的選擇
第二組,在雙甲脒標(biāo)液濃度均為1.0μg/mL、水解溫度為120℃條件下,加入不同濃度的鹽酸溶液,轉(zhuǎn)化率見(jiàn)圖8。結(jié)果表明:酸濃度適當(dāng)增大,水解加劇,隨著水解時(shí)間延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率不斷增大,30 min后基本達(dá)到平衡,水解基本完全,HCl介質(zhì)為1 mol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率保持在95%~99%,但酸濃度過(guò)大,水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),也會(huì)造成水解終產(chǎn)物進(jìn)一步消解。故本文選擇最佳水解條件為加1 mol/L HCl,于電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱中120℃放置30 min。
2.2.2 基質(zhì)效應(yīng)的影響分析
質(zhì)譜法農(nóng)殘檢測(cè)通常會(huì)考慮基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的影響,對(duì)樣品空白處理液采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)分析,分別取辣椒、黃瓜、茄子、西紅柿、梨、蘋(píng)果6種果蔬樣品空白基質(zhì)溶液各1.0 mL,準(zhǔn)確加入50.0 μg/mL 2,4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液各20.0 μL,與同濃度1.0 μg/mL 2,4-二甲基苯胺正己烷溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定峰面積響應(yīng)值比較(表3),得到基質(zhì)標(biāo)液響應(yīng)值與純?nèi)軇?biāo)液響應(yīng)值的比值為93.1%~113.0%。測(cè)定結(jié)果表明樣品處理液基質(zhì)效應(yīng)微乎其微,不存在明顯的基質(zhì)增益或抑制現(xiàn)象。
圖8 酸濃度與水解時(shí)間對(duì)水解轉(zhuǎn)化率的影響
表3 2,4-二甲基苯胺在純?nèi)軇┡c基質(zhì)溶液中的測(cè)定響應(yīng)比較
3.1.1 檢測(cè)器的選擇
雙甲脒及代謝物N-(2,4-二甲苯基)-N′-甲基甲脒即單甲脒在氣相GC-ECD上基本無(wú)響應(yīng),其水解產(chǎn)物2,4-二甲基苯胺在ECD檢測(cè)器上響應(yīng)很小,檢出限高,且樣品雜峰的干擾容易導(dǎo)致假陽(yáng)性判斷。而2,4-二甲基苯胺經(jīng)七氟丁酸酐衍生生成2,4-二甲基苯七氟丁酸胺后雖在ECD檢測(cè)器上有強(qiáng)響應(yīng),抗基質(zhì)干擾效果顯著,但七氟丁酸酐衍生反應(yīng)進(jìn)行緩慢,需后續(xù)處理,操作繁瑣耗時(shí),加之七氟丁酸酐高毒,會(huì)引發(fā)急性毒性,對(duì)操作者安全健康很不利。因此,本研究樣品水解液堿化后經(jīng)正己烷液液萃取,再采用GC-MS/MS直接分析2,4-二甲基苯胺,避免進(jìn)一步凈化造成的目標(biāo)物損失,以保留時(shí)間和質(zhì)譜雙重定性,選擇監(jiān)測(cè)離子對(duì)定量,可靠性也更高、抗干擾力更強(qiáng),能很好的減小雜質(zhì)干擾帶來(lái)的影響,對(duì)于種類多樣、多色素、多糖、含多種有機(jī)酸等復(fù)雜基質(zhì)的果蔬樣品非常適合,本底低、噪音小,靈敏度也更高。
3.1.2 水解產(chǎn)物的分析
雙甲脒及代謝物單甲脒農(nóng)殘的檢測(cè)不直接測(cè)其本體,是因?yàn)殡p甲脒易發(fā)生水解反應(yīng),在自然環(huán)境下會(huì)緩慢水解為單甲脒,隨時(shí)間的延長(zhǎng),單甲脒又進(jìn)一步水解為2,4-二甲基苯基甲酰胺、2,4-二甲基苯胺,還有小分子的甲胺、甲酸[17]等。其水解可在酸或堿條件的催化下加速進(jìn)行,水解速率與酸堿液的濃度相關(guān),濃度越大,水解越快。水解分步進(jìn)行,終產(chǎn)物一致[15-17],所以若雙甲脒水解進(jìn)行不完全,會(huì)產(chǎn)生以上多種中間產(chǎn)物,導(dǎo)致終產(chǎn)物2,4-二甲基苯胺轉(zhuǎn)化率不高、回收不理想。因此使其水解轉(zhuǎn)化徹底,再以2,4-二甲基苯胺含量換算雙甲脒含量,方法科學(xué)、準(zhǔn)確。
3.1.3 水解方式的選擇
雙甲脒及其代謝物的水解可用微波消解罐在電熱鼓風(fēng)干燥箱中恒溫進(jìn)行,罐中高溫高壓使得水解反應(yīng)速率呈倍增長(zhǎng),加快水解進(jìn)程、縮短水解時(shí)間、促進(jìn)反應(yīng)徹底,較之文獻(xiàn)方法采用的低溫水解及國(guó)標(biāo)法采用的回流水解,優(yōu)勢(shì)明顯:可實(shí)現(xiàn)水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化完全,多樣品同時(shí)進(jìn)行前處理,還省去了回流、冷凝裝置的安裝過(guò)程,極大的簡(jiǎn)化操作流程、提高工作時(shí)效、省時(shí)、省力、省空間。
3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇
采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,配制一組濃度呈梯度的雙甲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品同時(shí)進(jìn)行前處理(經(jīng)水解、萃?。┖螅玫玫降臉?biāo)準(zhǔn)溶液處理液上機(jī)測(cè)定,由于多種樣品的基質(zhì)干擾效應(yīng)并不明顯,無(wú)需加入基質(zhì)溶液,即得系列2,4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,用外標(biāo)法定量計(jì)算。對(duì)比用純?nèi)軇┲苯优渲频?,4-二甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線,省去換算2,4-二甲基苯胺與雙甲脒分子量之間的轉(zhuǎn)換系數(shù),還可消除水解萃取過(guò)程其回收率損失,使加標(biāo)回收更合理、有效反映測(cè)定的準(zhǔn)確性,確保分析結(jié)果穩(wěn)定、可靠。
已報(bào)道的文獻(xiàn)資料方法對(duì)食品中雙甲脒及其代謝物單甲脒的測(cè)定主要分兩類:一類是不經(jīng)水解,直接測(cè)定其樣品中雙甲脒或者雙甲脒和2,4-二甲基苯胺的含量,以雙甲脒計(jì)。此類方法未經(jīng)水解轉(zhuǎn)化,又忽略其它水解產(chǎn)物的含量,會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏小。第二類是樣品經(jīng)水解處理,再測(cè)定其水解終產(chǎn)物2,4-二甲基苯胺的含量,后換算成雙甲脒含量,以雙甲脒計(jì)。國(guó)標(biāo)法[7-8]水解反應(yīng)在強(qiáng)酸介質(zhì)120℃水浴條件下回流2 h,卻有文獻(xiàn)報(bào)道的水解反應(yīng)只于離心管內(nèi)在60~70℃恒溫干燥箱中靜置 30~50 min進(jìn)行[5-6,11],很顯然這些文獻(xiàn)檢測(cè)方法的反應(yīng)溫度、壓力、時(shí)間等設(shè)計(jì)不能滿足水解反應(yīng)的條件要求,從而水解進(jìn)行不完全,會(huì)造成測(cè)定含量偏小,測(cè)定不準(zhǔn)確。本文引入用微波消解罐于高溫高壓方式替代繁瑣的水浴回流方式進(jìn)行水解反應(yīng),應(yīng)用于雙甲脒及其代謝物的測(cè)定,提高水解反應(yīng)速率、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)高效。
綜上所述,本文用GC-MS/MS法對(duì)果蔬中雙甲脒及其代謝物殘留量的測(cè)定進(jìn)行研究和優(yōu)化,建立了用消解罐法進(jìn)行雙甲脒水解反應(yīng)的前處理方法,果蔬中雙甲脒在微波消解罐中酸催化水解得2,4-二甲基苯胺,經(jīng)過(guò)量堿液中和堿化,正己烷液液萃取,以外標(biāo)法定量計(jì)算得雙甲脒總殘留量。本方法的線性關(guān)系良好,靈敏度、精密度、回收率等均能滿足果蔬樣品農(nóng)殘的檢測(cè)要求,并簡(jiǎn)化前處理流程,為快速、準(zhǔn)確、批量的進(jìn)行果蔬樣品中雙甲脒總殘留量的檢測(cè)工作提供了參考。