金諾 王璐 張洲銘 同瑾 李德超

軟骨自身修復(fù)能力非常有限，創(chuàng)傷、代謝和炎癥均可引起不可逆的軟骨損傷，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨缺損，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量。目前，關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床治療方法主要有關(guān)節(jié)鏡技術(shù)，軟骨移植等，但至今仍沒有一種臨床方法可以實現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的再生[1]。隨著利用間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)治療難治性疾病的研究和臨床應(yīng)用不斷涌現(xiàn)，通過組織工程的方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損成為目前的研究熱點[2]。

脫細(xì)胞基質(zhì)支架是通過將生物組織通過脫細(xì)胞的方法獲得的低免疫排斥性的組織工程支架。其低免疫原性和良好的生物相容性成為組織工程的又一研究熱點[3]。經(jīng)過脫細(xì)胞處理的真皮、心包、角膜、血管、膀胱 食管、小腸黏膜基質(zhì)、骨、肝臟、肌肉、肌腱、腹壁等作為相應(yīng)組織的組織工程支架在動物實驗中均顯示出良好的應(yīng)用前景[4-8]。然而，脫細(xì)胞過程中引發(fā)的毒性試劑殘留以及支架理化性能的改變?nèi)韵拗屏嗣摷?xì)胞基質(zhì)的使用。尤其是關(guān)節(jié)缺損區(qū)往往為力學(xué)承載區(qū)和快速損耗部位，對材料的理化性能要求頗高，因此對組織工程支架的性能有著更苛刻的要求。

此研究優(yōu)化了軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，在去除同種異體軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)免疫原性的同時維持了支架的理化性能，并通過兔膝關(guān)節(jié)缺損模型驗證了材料的關(guān)節(jié)缺損修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)

新西蘭大白兔(新生2 周)(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實驗動物中心)肌肉注射過量戊巴比妥鈉(吉林華牧)猝死后取材。取兔耳浸泡于75%酒精中30 min，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)浸洗3 遍。去除耳部皮膚及耳軟骨骨膜，徹底游離兔耳軟骨。將兔耳軟骨剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片。用含青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 mg/ml)的PBS反復(fù)沖洗3 次。軟骨樣品加入含有0.2%膠原酶II型(Gibco，美國)含10%胎牛血清(Hyclone，美國)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，在搖床,37 ℃，120 r/mim，孵育12 h。消化完成后的軟骨細(xì)胞懸液使用200 目的濾網(wǎng)過濾后，1 000 r/min離心5 min；棄上清，重懸細(xì)胞。軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液：15%胎牛血清，L-谷氨酰胺(272 mg/ ml；Sigma,美國)，抗壞血酸2-磷酸酯(50 mg/ml；Sigma,美國)，10 ng/ml堿性磷酸酶10 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF,intitrogen，美國)的DMEM-低糖培養(yǎng)基。孵箱內(nèi)原代培養(yǎng)48 h后初次換液，其后隔天換液。顯微鏡(Leica，德國)下觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時，用胰酶(0.25%；索萊科技有限公司)消化傳代[9]。

取實驗兔脛骨，剪斷脛骨兩端，用DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液后離心，加入新的骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)液：10%胎牛血清(Hyclone，美國)的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，重懸，原代培養(yǎng)48 h后初次換液，其后隔天換液。待細(xì)胞貼壁生長到培養(yǎng)瓶底部面積的80%～90%時傳代。

1.2 軟骨脫細(xì)胞膜片的制備

取二代軟骨細(xì)胞，以1×107/cm2的密度接種在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，隔天換液。高密度培養(yǎng)3 周后，取出軟骨細(xì)胞膜片。數(shù)碼相機(jī)拍照后進(jìn)行常規(guī)HE染色和DAPI染色，在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察并拍照。用細(xì)胞刮刀輕輕刮起細(xì)胞膜片，并用PBS漂洗3 次，5 min/次；然后加入10 ml的1%SDS脫細(xì)胞液，置于37 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床內(nèi)孵育，在30 min,1 h 和4 h時換SDS，孵育24 h后，棄去脫細(xì)胞液，PBS漂洗3 次，5 min/次；加入適量的1% Triton-X100，30 min后倒掉脫細(xì)胞液，再加入適量的PBS搖床上120 r/min漂洗24 h，之后加入5 ml，0.5 mg/ml脫氧核糖核酸酶。PBS 漂洗脫細(xì)胞膜片3 次，15 min/次，在用PBS浸泡24 h[10]。

1.3 掃描電鏡

軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)放入6 孔板內(nèi)，無菌鋼環(huán)壓住膜片，加入BMSC細(xì)胞懸液，將MSC細(xì)胞與脫細(xì)胞基質(zhì)共同培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中(MSC+)，植入細(xì)胞第10天，將孔板中的培養(yǎng)基吸掉，固定、脫水、-80 ℃冷凍，冷凍干燥24 h。凍干后的單純軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)和負(fù)載細(xì)胞后的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)噴金后SEM觀察表面形態(tài)。

1.4 軟骨向分化相關(guān)基因的檢測

脫細(xì)胞膜片CO60放射48 h消毒，待用。實驗分3 組，在普通培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的BMMSCs(BMMSCs組);軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)放入6 孔板內(nèi)，無菌鋼環(huán)壓住膜片，加入BMMSCs細(xì)胞懸液，與軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)共培養(yǎng)但未接觸的BMMSCs(BMMSCs-組)；軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)表面接觸生長的BMMSCs(BMMSCs+ 組)。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育將3 組分別培養(yǎng)至3、 5、7和21 d后將各組BMMSCs用E.Z.N.A.Total Kit I提取試劑盒(OMEGA, 美國)提取樣本總 RNA，酶標(biāo)儀測總 RNA 濃度， PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA 后。取樣本 cDNA 進(jìn)行使用 PrimeScript RT Master Mix(Perpect Real Time)試劑盒(TakaRa，日本)反應(yīng)體系行Real-time PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40 次(表 1)。

表 1 實時定量PCR引物序列

1.5 動物分組及模型構(gòu)建

將新西蘭大白兔按0.05 ml/kg肌肉注射里陸眠寧誘導(dǎo)麻醉，10 min后耳緣靜脈按0.1 ml/kg注射1%戊巴比妥注射液進(jìn)行全身麻醉。碘伏消毒后鋪單，推開髕骨韌帶后于右腿膝關(guān)節(jié)外側(cè)做矢狀切口，分層剝離暴露膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面。用直徑為4 mm的環(huán)鋸在股骨膝關(guān)節(jié)面制造制造直徑為4 mm，深度為4 mm的骨和軟骨全層缺損，期間用生理鹽水進(jìn)行沖洗降溫。對照組：關(guān)節(jié)缺損空白對照；實驗組：將凍干滅菌的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)膜片植入關(guān)節(jié)缺損部位。復(fù)位髕骨韌帶，分層縫合傷口進(jìn)行縫合。術(shù)后連續(xù)按0.5 ml/kg肌肉注射0.5 g/ml先鋒3 d。術(shù)后12 周取材，觀察軟骨缺損區(qū)修復(fù)情況。

1.6 HE及免疫組化染色

用4%多聚甲醛固定軟骨細(xì)胞膜片和軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)，石蠟包埋切片后行HE染色(脫蠟至水后，將切片放入蘇木精染液中15 min，自來水洗5 min，用1%鹽酸酒精分化20 s，自來水漂洗2 min；弱堿性水返藍(lán)45 s；自來水漂洗10 min后開始伊紅染色，細(xì)胞質(zhì)染10 min；脫水透明后，用中性樹膠封片)和DAPI熒光染色并在-80 ℃冰箱過夜后凍干機(jī)凍干24 h。

處死動物取出膝關(guān)節(jié)樣本后，4%多聚甲醛固定48 h后浸泡在10%EDTA(雷根生物有限公司)脫鈣液脫鈣3 個月，脫鈣完成后石蠟包埋，切片(厚度：5 μm)。HE染色并用兔HITC試劑盒(中杉金橋)進(jìn)行COL-II染色，步驟參考說明書。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備

肉眼觀察軟骨細(xì)胞膜片呈毛玻璃狀(圖 1A)，經(jīng)脫細(xì)胞處理后呈透明膠凍樣物質(zhì)(圖 1D)。HE染色可見軟骨細(xì)胞膜片中的復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及大量細(xì)胞外基質(zhì)(圖 1B)，而軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的HE 染色顯示軟骨細(xì)胞全部去除，軟骨陷窩結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞外基質(zhì)成分完整，形成一個多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖 1E)。DAPI染色也可見軟骨細(xì)胞膜片中的大量細(xì)胞核染色(圖 1C)，而脫細(xì)胞膜片內(nèi)無細(xì)胞核染色(圖 1F)。說明本方法可良好去除組織內(nèi)的細(xì)胞成分(抗原成分)，并完整保存細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)架和理化性能。

2.2 軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可誘導(dǎo)BMMSCs軟骨向分化并分泌細(xì)胞外基質(zhì)

通過實時定量PCR檢測：I型膠原 (COL-I)、II 型膠原 (COL-II)、X型膠原(COL-X)、軟骨蛋白聚糖(Aggrecan)、 SOX-9在BMMSCs、BMMSCs-和BMMSCs+組的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)： BMMSCs+組中COL-I的表達(dá)量顯著低于BMMSCs、BMMSCs-組(P<0.01)，而BMMSCs-組中COL-I的表達(dá)量又明顯低于BMMSCs組。說明軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可通過接觸或非接觸的方式抑制BMMSCs的成骨向分化。接觸時間的延長對其成骨抑制作用并無明顯作用。

BMMSCs+組中COL-II的表達(dá)量顯著高于BMMSCs、BMMSCs-組(P<0.01)，而BMMSCs-組中COL-II的表達(dá)量又明顯低于BMMSCs組。說明軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可通過接觸或是非接觸的方式促進(jìn)BMMSCs的軟骨向分化。且軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)對BMMSCs可起持續(xù)的軟骨向誘導(dǎo)作用。在接觸前期，接觸時間越長，其誘導(dǎo)作用越強(qiáng)。

BMMSCs+組中COL-X的表達(dá)量顯著低于BMMSCs、BMMSCs-組(P<0.05)，而BMMSCs-組中COL-X的表達(dá)量又顯著低于BMMSCs組。說明軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可通過接觸或是非接觸的方式抑制BMMSCs的軟骨肥大和骨向分化。Aggrecan是軟骨的主要結(jié)構(gòu)大分子，3 組間并未見顯著差異，說明軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)對Aggrecan的合成并無顯著促進(jìn)作用。COL-II、Aggrecan基因表達(dá)升高的同時SOX-9也隨之增高且表達(dá)量顯著高于BMMSCs-、BMMSCs組。軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可能是通過SOX-9通路通過接觸或是非接觸的方式促進(jìn)BMMSCs的軟骨向分化(表 2)。

表 2 軟骨向分化相關(guān)基因的表達(dá)

掃描電鏡觀察可見軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)表面粗糙度良好，顯示出良好的親水性，并可見部分細(xì)胞陷窩(圖 2A)。將BMMSCs種植與DCM表面7 d后的可見細(xì)胞黏附于DCM支架表面，并長入軟骨陷窩內(nèi)。DCM上大量細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可見偽足伸出，并可見大量細(xì)胞外基質(zhì)分泌(圖 2B)。以上結(jié)果顯示軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)支架生物相容性良好，無明顯細(xì)胞毒性，與DCM接觸可促進(jìn)BMMSCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)。

2.3 軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)促進(jìn)兔關(guān)節(jié)缺損的修復(fù)

術(shù)后12 周取材對照組在軟骨缺損區(qū)仍可見明顯的中央凹陷區(qū)及缺損界限(圖 3A)。HE染色也可見對照組缺損區(qū)新生軟骨與周圍正常軟骨質(zhì)間有明顯界限(圖 3B)，軟骨下骨質(zhì)骨化不全。免疫組織化學(xué)染色顯示缺損區(qū)表面Ⅱ型膠原表達(dá)量尚可但不均一(圖 3C)。

與對照組相比，實驗組軟骨缺損基本修復(fù)，表面覆蓋軟骨較完整，缺損區(qū)軟骨與周圍軟骨邊界移行良好(圖 3D)。HE染色見實驗組缺損區(qū)新生軟骨與周圍正常軟骨質(zhì)地相似并融合良好，且軟骨下骨質(zhì)恢復(fù)良好(圖 3E)。實驗組軟骨缺損區(qū)表面Ⅱ型膠原表達(dá)豐富且均勻，與周圍正常軟骨的表達(dá)量基本一致(圖 3F)。

圖 2 DCM用于兔膝關(guān)節(jié)缺損的修復(fù)

圖 3 DCM可良好修復(fù)兔關(guān)節(jié)缺損

3 討 論

成熟的軟骨沒有血管、神經(jīng)組織和淋巴管，因此，如有損傷，其自我修復(fù)能力非常有限，損傷往往最終導(dǎo)致嚴(yán)重的軟骨病變，如關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)退變等[1]。目前骨缺損的治療方式包括自體或異體軟骨移植。但是自體骨移植存在很多問題如：來源有限、供區(qū)損傷和增加患者痛苦等缺點。而異體軟骨移植也有與宿主存在排斥反應(yīng)和來源受限等問題。不過隨著組織工程學(xué)的興起和發(fā)展，關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的修復(fù)將成為可能[11]。

軟骨組織工程是通過植入結(jié)構(gòu)和功能上類似軟骨的支架，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和再生。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)即組織中除細(xì)胞以外的所有成分，其中的膠原，非膠原糖蛋白 彈性蛋白 糖胺多糖等都具有重要的生物學(xué)性能，對細(xì)胞形狀，細(xì)胞的遷移、增值、分化和代謝等有著直接的影響，其本身即是一種良好的組織工程支架材料。實驗表明組織脫細(xì)胞基質(zhì)可以為干細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境，并在誘導(dǎo)干細(xì)胞的定向分化，最終達(dá)到組織再生的目的[10,12]。但是脫細(xì)胞不全以及脫細(xì)胞試劑的殘留是導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)和材料毒性是修復(fù)失敗的原因。本研究用過體外擴(kuò)增軟骨細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，并通過脫細(xì)胞等方法去除同種異體移植物的免疫原性來制造組織工程軟骨支架。研究發(fā)現(xiàn)，通過體外培養(yǎng)的軟骨膜片脫細(xì)胞徹底，免疫原性和細(xì)胞毒性極低，并且可以良好保持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的理化性能和軟骨誘導(dǎo)活性。BMMSCs是骨髓來源的具有多向分化潛能的干細(xì)胞,可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。關(guān)節(jié)損傷后，關(guān)節(jié)下方的骨髓腔則會就近提供BMMSCs參與組織修復(fù)[13-14]。因此該研究選擇將BMMSCs與軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)共同培養(yǎng)來模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)情況，從而客觀反映材料的生物相容性及對BMMSCs分化的影響[15]。SEM觀察到BMMSCs在軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)表面粘附良好，不但維持了BMMSCs的增殖能力還促進(jìn)了BMMSCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)。qPCR發(fā)現(xiàn)BMMSCs與軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)接觸時COL-II表達(dá)量顯著高于BMMSCs-、BMMSCs組，并且在前期隨著時間增加，誘導(dǎo)能力還有所增強(qiáng)。COL-II是軟骨的重要組成部分，是BMMSCs軟骨向分化的標(biāo)志蛋白。SOX-9是BMMSCs軟骨向分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[16]，研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs與軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)接觸時SOX-9的表達(dá)在BMMSCs+組同樣較高，并且在前期隨著時間增加，表達(dá)量持續(xù)提高，因此軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可能是通過SOX-9通路誘導(dǎo)了BMMSCs的軟骨向分化。COL-I和COL-X為BMMSCs的骨向分化以及軟骨肥大的標(biāo)志蛋白，二者表達(dá)在BMMSCs+中明顯降低且較BMMSCs-、BMMSCs組低，表明軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)抑制了BMMSCs的軟骨肥大和骨向分化。通過SEM也觀察到軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可促進(jìn)BMMSCs的外基質(zhì)合成和分泌。

之后觀察了同種異體軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)在修復(fù)新西蘭大白兔關(guān)節(jié)缺損中的治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組的關(guān)節(jié)表面較對照組更加平整，與周邊正常軟骨結(jié)構(gòu)融合更好。說明軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)不但可以促進(jìn)關(guān)節(jié)缺損區(qū)的軟骨修復(fù)，還可以快速誘導(dǎo)軟骨下骨支持結(jié)構(gòu)的形成。推測脫細(xì)胞基質(zhì)膜片是通過在缺損區(qū)快速形成軟骨后，通過軟骨內(nèi)骨化來促進(jìn)軟骨下骨支持結(jié)構(gòu)形成的。此種修復(fù)方式也符合正常關(guān)節(jié)生長發(fā)育的生理模式。關(guān)節(jié)脫鈣后通過HE染色和COL-II的免疫組織化學(xué)染色觀察了軟骨缺損區(qū)結(jié)構(gòu)微觀修復(fù)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組新生軟骨與正常軟骨結(jié)構(gòu)相似并與周圍軟骨較多融合，軟骨下骨組織恢復(fù)更好，COL-II表達(dá)量更高，表達(dá)量接近周圍正常軟骨。

綜上所述，軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)是一種可以誘導(dǎo)BMMSCs軟骨向分化的優(yōu)良組織工程支架。通過改進(jìn)，大大降低了同種異體軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的免疫原性和細(xì)胞毒性，在體內(nèi)關(guān)節(jié)缺損的修復(fù)中取得了滿意的治療效果，為同種異體軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)在關(guān)節(jié)缺損的臨床應(yīng)用提供了良好的理論支持。