段德明，季永飄，周夢(mèng)潔，高基民

中試制備臨床級(jí)別第三代慢病毒

段德明，季永飄，周夢(mèng)潔，高基民

溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035

基因治療是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，其中關(guān)于慢病毒介導(dǎo)的外源基因?qū)胙芯康米顬閺V泛。隨著研發(fā)技術(shù)的不斷發(fā)展，在安全性方面慢病毒已經(jīng)從第一代發(fā)展至第三代，而如何工程化獲得高滴度慢病毒仍是當(dāng)今技術(shù)一大瓶頸。運(yùn)用Fibra-Cel片狀載體作為HEK293T細(xì)胞載體基質(zhì)，聯(lián)合多個(gè)無(wú)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶在滾瓶機(jī)上培養(yǎng)，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行規(guī)模放大化生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)第三代慢病毒包裝過(guò)程中影響慢病毒滴度的因素進(jìn)行逐一篩選，使病毒滴度達(dá)到最優(yōu)。研究結(jié)果成功運(yùn)用Fibra-Cel片狀載體作為HEK293T細(xì)胞粘附載體基質(zhì)，作為一種貼壁細(xì)胞規(guī)模放大的方法，篩選出了利用滾瓶機(jī)制備第三代慢病毒的最優(yōu)條件，規(guī)?；a(chǎn)了3批慢病毒。在時(shí)間上，將慢病毒的生產(chǎn)時(shí)間從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到病毒收集的120 h縮短至54 h；在成本上，利用滾瓶機(jī)代替生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了無(wú)需反復(fù)滅菌、全程一次性產(chǎn)品的安全有效低成本的運(yùn)行，為慢病毒的規(guī)?；苽涮峁┝思夹g(shù)上的支持，為臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

慢病毒，規(guī)模化制備，F(xiàn)ibra-Cel，基因治療，CAR-T

20世紀(jì)90年代，慢病毒載體作為一種安全替代品開(kāi)始漸漸取代γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，由于慢病毒載體既能將基因插入到分裂細(xì)胞也能插入到非分裂細(xì)胞[1-2]中，且目的基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期而穩(wěn)定的表達(dá)，使其迅速成為基因修飾和細(xì)胞治療中的重要工具。

隨著對(duì)慢病毒的不斷研究和開(kāi)發(fā)，慢病毒從第一代開(kāi)展至第三代，第一個(gè)改進(jìn)是該載體系統(tǒng)病毒只有HIV-1 Gag、Pol、Rev和VSV-G蛋白，沒(méi)有活性L(fǎng)TR、Tat或輔助蛋白，可以顯著增加其生物安全性。第二個(gè)改進(jìn)就是從表達(dá)質(zhì)粒中的3′ LTR中刪除了U3區(qū)域內(nèi)的TATA盒、Sp1和NF-kB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[3-6]，這些載體稱(chēng)為自滅活載體 (Self-inactivating vector，SIN)，其長(zhǎng)末端重復(fù)序列的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子被刪除，從理論上降低了附近基因被激活的風(fēng)險(xiǎn)。在逆轉(zhuǎn)錄之后，U3區(qū)域內(nèi)的3′ LTR缺失被轉(zhuǎn)移到原病毒DNA的5′ LTR的U3區(qū)域，引起LTR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄失活，阻止了全長(zhǎng)載體的RNA的表達(dá)，這種改進(jìn)降低了野生型HIV病毒感染后載體活化的可能性[7-9]。第3個(gè)改進(jìn)就是在慢病毒載體骨架上加入了土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(Wood chuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element, WPRE)，它可增強(qiáng)mRNA轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性，提高第三代載體的表 達(dá)[10-12]。Salk的報(bào)道中指出，在慢病毒載體中添加WPRE后，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高了5倍[13-15]。

慢病毒載體的運(yùn)用十分廣泛，在轉(zhuǎn)向臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)需要大量的慢病毒載體，而將生產(chǎn)工藝放大則顯得極為重要?？梢酝ㄟ^(guò)擴(kuò)展方法(增加生產(chǎn)單元) 即單純的擴(kuò)大“2D”培養(yǎng)方法，也可以通過(guò)采用懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，后者比貼壁細(xì)胞更容易放大規(guī)模，而懸浮化貼壁依賴(lài)型細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞的體積/密度比，對(duì)于商品制造者來(lái)說(shuō)，載體基質(zhì)培養(yǎng)具有諸多優(yōu)點(diǎn)。在簡(jiǎn)單的懸浮培養(yǎng)、流化床或填充床系統(tǒng)中使用載體基質(zhì)，每1 mL可能得到2×108個(gè)細(xì)胞。選擇正確的載體基質(zhì)取決于培養(yǎng)細(xì)胞的類(lèi)型和培養(yǎng)的目的。本研究在已經(jīng)成熟的“2D”培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上，縱向擴(kuò)展——“3D”懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)體系如細(xì)胞密度、載體基質(zhì)濃度、轉(zhuǎn)瓶速度、聚醚酰亞胺(Polyetherimide)∶DNA比例、總質(zhì)粒濃度、丁酸鈉濃度以及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的慢病毒規(guī)模化制備條件，為臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-MEM、RPMI1640及細(xì)胞培養(yǎng)其他成分HEPES、D-PBS，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；Fibra-Cel購(gòu)自Eppendorf公司；Cytodex1、Cytodex3購(gòu)自GE Healthcare公司；polybrene、PEI購(gòu)自Sigma公司；內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門(mén)鱟試劑生物科技公司；雙鏈DNA定量試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物。

1.2 儀器與設(shè)備

流式細(xì)胞分析系統(tǒng) (BD FACS Aria)，細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo)，超速離心機(jī) (Beckman Coulter)，熒光顯微鏡，冷凍真空干燥機(jī)、超低溫冰箱和核酸蛋白電泳系統(tǒng)，臺(tái)式高速離心機(jī) (Eppendorf 5415D)，凝膠成像系統(tǒng)為 Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)粒提取

質(zhì)粒加到感受態(tài)Stbl3里，依次冰上放置5 min，42 ℃水浴鍋熱激90 s，冰上放置5 min后，三區(qū)劃線(xiàn)的方法涂布于氨芐平板上。37 ℃培養(yǎng)12–16 h后取出平板后挑取單個(gè)菌落接種至含0.1%氨芐的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)14–16 h。

收獲細(xì)菌，6 000×、4 ℃離心15 min，然后依次加入10 mL Buffer P1、P2、P3，劇烈晃動(dòng)離心管4–6次后室溫過(guò)濾，加2.5 mL緩沖液ER至溶菌液，冰上孵育30 min，10 mL QBT潤(rùn)洗QIAGEN-tip 500柱子，用15 mL緩沖液QN洗脫DNA，加入10.5 mL異丙醇使DNA沉淀下來(lái)，混勻，15 000×、4 ℃離心30 min，棄上清，5 mL 70%乙醇，15 000×、4 ℃離心10 min，棄上清后烘干質(zhì)粒。檢測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度并記錄，保存于?20 ℃。

1.3.2 Fibra-Cel的處理和回收

用電子天平稱(chēng)取一定量的Fibra-Cel載體，1 g載體加入5 mL的PBS，混勻密封，4 ℃過(guò)夜后，121 ℃高壓滅菌30 min，4 ℃保存。

將用過(guò)的載體基質(zhì)移至玻璃器皿，用清水洗滌3次。向洗滌后的載體基質(zhì)中加入0.1 mol/L醋酸浸泡4–6 h，再用清水洗滌3–5次，烘干滅菌后備用。

1.3.3 細(xì)胞鋪板于Fibra-Cel載體基質(zhì)

配制DMEM完全培養(yǎng)基，從4 ℃取出PBS、已水化高壓的Fibra-Cel載體基質(zhì)常溫復(fù)溫。提前將滾瓶機(jī)打開(kāi)，紫外照射30 min，溫度調(diào)至37 ℃，CO2濃度調(diào)至5%。取1 L的未處理細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶，放入6 g Fibra-Cel載體基質(zhì)。取3×108細(xì)胞，300 mL完全培養(yǎng)基于已加Fibra-Cel的細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放至滾瓶機(jī)上，8 r/min旋轉(zhuǎn)2 h。

1.3.4 慢病毒包裝

準(zhǔn)備a、b兩個(gè)無(wú)菌的離心管，分別加入5 mL的PBS，在a管中加入一定比例的PEI，在b管中加入目的質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒靜置5 min后將a管中試劑加入b管中，輕輕混合均勻。室溫孵育20 min后，將混合物移至細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.3.5 慢病毒滴度檢測(cè)

96孔板每孔鋪0.2×106–0.5×106Jurkat細(xì)胞， 200 μL/孔，以1∶10的比例將病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，32 ℃、1 200×離心90 min。4 h 后用DPBS將細(xì)胞洗一次后鋪于12孔板，轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將陽(yáng)性細(xì)胞群圈出后，計(jì)算病毒滴度。病毒滴度=(*)/(*) [=病毒滴度 (TU/mL)，=流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的陽(yáng)性細(xì)胞比例 (如=0.2即陽(yáng)性細(xì)胞占20%)，=轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)，=轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)病毒稀釋倍數(shù)，=轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)的體積]。

1.3.6 雙鏈DNA (dsDNA) 定量檢測(cè)

向一次性微量比色皿中依次加入梯度性Tris-EDTA緩沖液和2 μg/mL小牛胸腺 DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃縮液，隨后加入1 mL PicoGreen定量試劑，混勻后，于室溫避光孵育2–5 min，并以1×TE緩沖液為空白對(duì)照，以此結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，向96孔板中加入TE和2 μg/mL小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)濃縮液，隨后加入100 μL PicoGreen定量試劑，混勻，于室溫避光孵育2–5 min，熒光酶標(biāo)儀中檢測(cè)各濃度熒光值，Ex/Em=480 nm/520 nm。

1.3.7 BSA殘留檢測(cè)

在酶標(biāo)板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為90、60、30、15、7.5 μg/L。封板膜封板后置37 ℃溫育30 min后小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。然后顯色，先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度 (450)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算BSA殘留量。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

包裝質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室的第三代慢病毒質(zhì)粒，如圖1所示，載體質(zhì)粒含有報(bào)告基因Zsgreen。慢病毒包裝后成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)綠色熒光蛋白，這使得它們易于檢測(cè)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)載體的選擇

為使細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)能懸浮化生長(zhǎng)，我們?cè)u(píng)估了細(xì)胞的培養(yǎng)載體類(lèi)型。固定接種5×105個(gè)/mL細(xì)胞，分別考察微載體 Cytodex l、Cytodex3和Fibra-Cel對(duì)細(xì)胞增殖的影響。每組考察實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)48 h的微載體培養(yǎng)，細(xì)胞密度均有所增加，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞在載體上的生長(zhǎng)情況 (圖2A)。利用微載體Cytodex 1培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，細(xì)胞增殖不顯著；Cytodex 3細(xì)胞密度均增加為最初接種時(shí)的近4–5倍，而利用片狀載體Fibra-Cel近 7–9倍，且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的慢病毒載體滴度最高 (圖2B)。因此，本實(shí)驗(yàn)確定使用片狀載體Fibra-Cel進(jìn)行HEK293T細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的細(xì)胞載體基質(zhì)。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化

細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響了慢病毒的生產(chǎn)滴度，故大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒載體需要高產(chǎn)量的HEK293T細(xì)胞[16]。為了優(yōu)化出HEK293T細(xì)胞在Fibra-Cel載體基質(zhì)上富集程度，我們以20 g/L片狀載體Fibra-Cel，在2 r/min、4 r/min、6 r/min、8 r/min、10 r/min轉(zhuǎn)速下，使細(xì)胞與載體基質(zhì)充分接觸著床后，消化載體基質(zhì)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞富集率(圖3A)，通過(guò)顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞在載體上的生長(zhǎng)情況 (圖3B)。結(jié)果顯示，在8 r/min轉(zhuǎn)速的轉(zhuǎn)瓶中旋轉(zhuǎn)2 h，可保證HEK293T細(xì)胞高效率的著床于載體基質(zhì)上，且細(xì)胞密度在106/mL和2×106/mL時(shí)有相近的富集率。

2.4 病毒包裝條件優(yōu)化

為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶作為生產(chǎn)慢病毒載體的平臺(tái)，我們優(yōu)化了包裝病毒的條件，包括丁酸鈉的濃度、PEI與DNA的質(zhì)量比、總質(zhì)粒 (μg/mL) 的濃度，并且以此條件成功包裝出高滴度并具有生物學(xué)功能的慢病毒。

圖1 載體質(zhì)粒及第三代慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 生產(chǎn)培養(yǎng)基中丁酸鈉濃度對(duì)慢病毒包裝滴度的影響

丁酸鈉是一種有效的組蛋白去乙?；种苿菇M蛋白高度乙?；瑥亩梢砸鹑旧|(zhì)的解聚，使轉(zhuǎn)染的DNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)更高[17-19]。在細(xì)胞鋪板載體基質(zhì)48 h后，我們更換DMEM培養(yǎng)基，單一變量變化，使用丁酸鈉0 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L、9 mmol/L、12 mmol/L的培養(yǎng)基包裝病毒，收集48 h的上清液，流式細(xì)胞術(shù)確定慢病毒的功能滴度。結(jié)果顯示 (圖4A)，培養(yǎng)基中丁酸鈉濃度為3 mmol/L時(shí)慢病毒滴度最高，但與未添加丁酸鈉的培養(yǎng)基相比未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為減少慢病毒生產(chǎn)后下游處理，未選擇丁酸鈉作為增加慢病毒包裝條件。

圖4 病毒包裝條件的優(yōu)化

2.4.2 PEI對(duì)慢病毒包裝滴度的影響

傳統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、PEI、LIP2000和POLYJET等，其中PEI兼具成本低、轉(zhuǎn)染效率高、影響轉(zhuǎn)染效率因素少等優(yōu)點(diǎn)，故本研究選用PEI為規(guī)模化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)染陽(yáng)離子聚合物。PEI可與DNA的磷酸酯鍵形成離子相互作用，形成濃縮的PEI-DNA復(fù)合物。在一定量的DNA的情況下，我們推測(cè)不同的PEI/DNA比例對(duì)病毒滴度有影響。細(xì)胞在載體基質(zhì)上培養(yǎng)48 h后，分別以PEI∶總質(zhì)粒質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1包裝慢病毒。結(jié)果顯示 (圖4B)，在PEI∶總質(zhì)粒質(zhì)量比為3∶1、4∶1時(shí)，可獲得 107TU/mL 的慢病毒，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者無(wú)明顯差異。由于PEI具有一定的細(xì)胞毒性，在生產(chǎn)或純化慢病毒時(shí)缺少檢測(cè)及定量PEI的方法來(lái)判定PEI是否會(huì)和慢病毒共純化，以及共純化的水平是否會(huì)破壞慢病毒的感染能力和穩(wěn)定性，因此選擇PEI∶總質(zhì)粒質(zhì)量比為3∶1作為規(guī)模化包裝所用的比值。

2.4.3 總質(zhì)粒量對(duì)慢病毒包裝滴度的影響

有研究表明，當(dāng)從培養(yǎng)皿擴(kuò)大到細(xì)胞工廠(chǎng)時(shí)，質(zhì)?？倽舛瓤梢园幢壤糯骩20]，利用懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒是可行的，且擁有良好的產(chǎn)量。但在轉(zhuǎn)移到中試生產(chǎn)之前，該技術(shù)還需要進(jìn)一步完善。優(yōu)化的主要瓶頸是轉(zhuǎn)染過(guò)程本身，PEI無(wú)法沉降到細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶中Fibra-Cel載體基質(zhì)的細(xì)胞層上，而細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中定義的最佳質(zhì)粒濃度是有限的，故需要對(duì)總質(zhì)粒的量進(jìn)行優(yōu)化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將總質(zhì)粒濃度從0.8 mg/mL增加到1.6 mg/mL，可以將Fibra-Cel上產(chǎn)生的慢病毒的滴度提高大約兩倍 (圖4C)。隨著總質(zhì)粒濃度的繼續(xù)增加，慢病毒包裝的生物功能滴度呈下降趨勢(shì)。

2.5 關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的探索

2.5.1 細(xì)胞鋪板不同時(shí)間后轉(zhuǎn)染

接下來(lái)，我們優(yōu)化了兩個(gè)關(guān)鍵的時(shí)間變量：轉(zhuǎn)染混合物的加入時(shí)間和慢病毒包裝后的收集時(shí)間。

為了探索細(xì)胞形態(tài)對(duì)慢病毒生產(chǎn)的影響，我們以1×106/mL細(xì)胞密度接種于Firba-Cel載體基質(zhì)，在細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中以8 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)混勻2 h后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)0 h、2 h、48 h、72 h后將質(zhì)粒加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，進(jìn)行慢病毒生產(chǎn)。結(jié)果顯示 (圖5A)，在HEK293T細(xì)胞落在載體基質(zhì)并培養(yǎng)2 h后即刻進(jìn)行慢病毒包裝，慢病毒原液滴度可達(dá)18×106TU/mL。一般情況下，我們認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞粘附于載體基質(zhì)上，細(xì)胞骨架完全伸開(kāi)密度達(dá)80% 時(shí)可獲得較優(yōu)的滴度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞在貼壁的早期階段所產(chǎn)生的慢病毒滴度最高，這可能和細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性有關(guān)。

2.5.2 第一次收取病毒時(shí)間

HEK293T細(xì)胞表面廣泛表達(dá)LDL-R，當(dāng)細(xì)胞上清內(nèi)的病毒VSV-G可以識(shí)別并結(jié)合HEK293T細(xì)胞表面LDL-R，HEK293T細(xì)胞通過(guò)胞吞的形式再次使病毒進(jìn)入細(xì)胞，從而使上清中的病毒數(shù)量減少。當(dāng)上清中的實(shí)際病毒數(shù)量 (生產(chǎn)的病毒總數(shù)?進(jìn)入細(xì)胞的病毒數(shù)) 最大時(shí)，即可獲最大慢病毒滴度。

圖5 在Fibra-Cel上擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞

我們分別于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的10 h、19 h、24 h、36 h、38 h、48 h收取上清。結(jié)果顯示，在 38 h時(shí)，上清中的實(shí)際病毒數(shù)量達(dá)到最大值 (圖5C)，隨著時(shí)間增加，細(xì)胞所產(chǎn)病毒減少，進(jìn)入細(xì)胞的病毒數(shù)增加，上清病毒反而降低。HEK293T細(xì)胞以300 mL規(guī)模接種到細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中的Fibra-Cel上，葡萄糖48 h內(nèi)水平降低更多，表明代謝活躍細(xì)胞隨著時(shí)間的推移而增多(圖5B)。

2.5.3 第二次收取病毒時(shí)間

在某些情況下，可通過(guò)增加收集次數(shù)來(lái)提高最終慢病毒的質(zhì)量。我們?cè)谑占谝淮尾《驹汉螅鼡Q10% FBS的DMEM，再次放入培養(yǎng)箱產(chǎn)毒，分別于8 h、12 h、16 h、20 h、24 h后收集第二次上清。結(jié)果顯示 (圖5D)，在換液12 h后，獲得病毒原液的生物學(xué)功能滴度最高。

2.6 GMP生產(chǎn)

GMP (Good manufacture practices)，即藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范，用上述優(yōu)化條件作為規(guī)?；《旧a(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)工作程序 (圖6)，并生產(chǎn)3批高滴度GMP級(jí)GFP慢病毒載體產(chǎn)物 (表1)。這3批慢病毒進(jìn)行濃縮后檢測(cè)支原體、真菌、細(xì)菌、內(nèi)毒素、殘留DNA、BSA殘留均符合歐盟國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) (表2)，病毒濃縮后保存于?80 ℃。

圖6 臨床制造流程圖

表1 滾瓶機(jī)中生產(chǎn)慢病毒

表2 主要質(zhì)控指標(biāo)

3 討論

近年來(lái)，慢病毒載體的發(fā)展非常迅速，從第一代到第三代的四質(zhì)粒系統(tǒng)[21-23]，隨著科學(xué)家對(duì)于載體質(zhì)粒的不斷優(yōu)化，慢病毒的安全性也得到了很大程度的提高[12,24-26]。但是，在臨床試驗(yàn)開(kāi)展的整體過(guò)程中，不僅要求慢病毒要有十分高的安全性，還要求慢病毒有足夠多的具有生物學(xué)功能的病毒顆粒，因此對(duì)慢病毒生產(chǎn)時(shí)的滴度和生產(chǎn)后的下游加工提出了更高的要求。

我們?cè)诖嗣枋隽耸褂肞EI瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)高安全性第三代慢病毒載體的可擴(kuò)展制造平臺(tái)開(kāi)發(fā)?；跐L瓶機(jī)聯(lián)合多個(gè)透氣表面未處理的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶封閉系統(tǒng)處理技術(shù)，一臺(tái)滾瓶機(jī)亦可產(chǎn)0.3–500 L病毒原液，且無(wú)需在每批運(yùn)行之間進(jìn)行滅菌或必要的清潔。

轉(zhuǎn)染的規(guī)?；a(chǎn)需要仔細(xì)分析和優(yōu)化處理步驟，轉(zhuǎn)染過(guò)程和載體收集都是有時(shí)間依賴(lài)性的，并且受到本研究中所證明的許多變量的影響。有報(bào)告指出，若未能在最佳“感受”條件下生產(chǎn)慢病毒，最高可導(dǎo)致生產(chǎn)力降低10倍以上[27-28]，此外培養(yǎng)時(shí)間也對(duì)轉(zhuǎn)染具有很大程度的影響。在測(cè)試的變量中，我們發(fā)現(xiàn)幾個(gè)關(guān)鍵的影響因素，其中包括在細(xì)胞收獲前用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度。我們確定轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞的最佳細(xì)胞接種密度為106/mL。然而，細(xì)胞密度對(duì)病毒滴度的影響是否適用于其他載體類(lèi)型以及這是否對(duì)慢病毒載體具有特異性仍有待研究。其他變量發(fā)現(xiàn)影響病毒滴度的因素包括轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基更換的時(shí)間和轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用的質(zhì)粒濃度。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第一次收取的最佳時(shí)間為38 h，第二次收取的最佳時(shí)間為12 h。同時(shí)，1.6 μg/mL是規(guī)?；苽渲修D(zhuǎn)染的最佳質(zhì)粒濃度。其中通過(guò)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒載體的結(jié)果顯示，質(zhì)粒的量從每瓶1.6 μg/mL增加至2.0或2.4 μg/mL 時(shí)，實(shí)際上卻大大降低了病毒滴度。最后，我們總結(jié)了使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒載體的新型制造平臺(tái)的優(yōu)化參數(shù)并生產(chǎn)3批慢病毒載體。

病毒的質(zhì)量控制主要包括外觀(guān)、可見(jiàn)異物、目的載體鑒別、pH、純度、病毒滴度、無(wú)菌檢查、工藝相關(guān)雜質(zhì) (如DNA殘留、牛血清白蛋白殘留，核酸殘留等) 及細(xì)菌內(nèi)毒素等。生產(chǎn)的3批慢病毒的各項(xiàng)質(zhì)控均符合歐盟的標(biāo)準(zhǔn)值，而針對(duì)每一個(gè)特定的病毒載體，需根據(jù)病毒載體及其生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)建立特定的質(zhì)量控制檢測(cè)及要求，建立相應(yīng)的病毒載體參比品。

工藝開(kāi)發(fā)需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件摸索和優(yōu)化，基于瞬態(tài)轉(zhuǎn)染的平臺(tái)一旦開(kāi)發(fā)成功，就可以發(fā)揮其最大的靈活性，以節(jié)省成本和時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)的探索實(shí)現(xiàn)了慢病毒的規(guī)?；苽?，利用滾瓶機(jī)實(shí)現(xiàn)了無(wú)需反復(fù)滅菌、全程一次性產(chǎn)品的安全有效低成本的運(yùn)行，在快速發(fā)展的基因治療領(lǐng)域中，可用于慢病毒載體的大規(guī)模臨床生產(chǎn)。

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Pilot-scale preparation of clinical-grade third generation lentivirus

Deming Duan, Yongpiao Ji, Mengjie Zhou, and Jimin Gao

School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, Zhejiang, China

Gene therapy is a rapidly developing field. The most widely used technique for foreign gene transfer is lentiviral-mediated gene therapy. Lentiviral vector has been developed from the first generation to the third generation in terms of safety. The preparation of lentiviruses with high titer remains difficult. In this study, a Fibra-Cel sheet carrier was used as an HEK293T cell carrier matrix, and several sterile cell culture spinners were combined and cultured on a roller bottle machine to scale up the adherent cells. The virus titer was maximized by screening the factors to optimize the lentivirus titer in the third-generation lentivirus packaging process one by one. Fibra-Cel sheet vector was successfully used as the matrix of HEK293T cell adhesion to culture adherent cells at large scale. The optimal conditions for large-scale preparation of the third-generation lentivirus by bottle roller were screened and three batches of lentiviruses were produced on pilot scale. The production time of lentivirus was shortened from 120 hours to 54 hours from plasmid transfection to virus collection; in terms of cost, a rolling bottle machine was used instead of a bioreactor, leading to lower cost and no need for repeated sterilization during the whole process. The safe, effective and low-cost operation of successful production will provide a technical base for the large-scale preparation of lentivirus and thus lay a firm foundation for its clinical application.

lentivirus, large-scale preparation, Fibra-Cel, gene therapy, CAR-T

April 7, 2019;

June 14, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 81573110, 91729101).

Jimin Gao. Tel: +86-577-86699341; E-mail: jimingao64@yahoo.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 81573110, 91729101) 資助。

2019-06-24

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190621.1426.001.html

段德明, 季永飄, 周夢(mèng)潔, 等. 中試制備臨床級(jí)別第三代慢病毒. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(7): 1307–1316.

Duan DM, Ji YP, Zhou MJ, et al. Pilot-scale preparation of clinical-grade third generation lentivirus. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1307–1316.

(本文責(zé)編 陳宏宇)