何 斌，冉志平，周 琦，張海靜，楊文海，邵志勇，吳利軍，陳夏冰，陳 潔，操繼躍

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430208；2.華中農(nóng)業(yè)大學，武漢430070；3.天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務中心，天津301800）

牛蒡子是一種常用中藥，具有疏散風熱、宣肺透疹功效，臨床上用于治療外感風熱、咳嗽氣喘、咽喉腫痛等癥［1］。牛蒡苷元為牛蒡子和牛蒡子提取物的直接有效成分［2］，具有抗炎［3］、抗病毒［4］、抗腫瘤［5］、抗糖尿病［6］等眾多藥理作用，具有良好的研發(fā)和應用前景；目前，國內(nèi)外未見牛蒡苷元及牛蒡子提取物的安全性評級研究，本文根據(jù)獸藥指導原則經(jīng)口給藥急性毒性試驗要求，研究了牛蒡苷元及牛蒡子水提物在昆明小鼠體內(nèi)經(jīng)口給藥后的急性毒性，為新獸藥的研發(fā)和臨床用藥提供理論資料，為中獸藥現(xiàn)代化進行有意義的探索。

1 材 料

1.1 儀器設備 注射器、燒杯、小鼠灌胃針；小鼠獨立送風（IVC）系統(tǒng)；手術剪、鑷子，JY2002型電子天平、島津AUY2002型分析天平等。

1.2 藥品與試劑 牛蒡苷元：含量98.12%，由武漢市畜牧獸醫(yī)科學研究所動物疾病防控學科實驗室自制；牛蒡子提取物：牛蒡苷元含量3.10%，由武漢市畜牧獸醫(yī)科學研究所動物疾病防控學科實驗室自制，使用時，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成混懸液；羧甲基纖維素鈉：由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，使用時，用蒸餾水配制成0.5%的水溶液，冷處放置，限7 d內(nèi)使用。二甲亞砜、丙二醇、乙醇：購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要溶液的配制 牛蒡苷元溶液的制備：分別準確稱取牛蒡苷元 200.0、159.0、126.0、100.0、79.5、63.0、50.0 mg，置于 10 mL 容量瓶中，加入少量二甲亞砜助溶，配制成濃度分別為20.0、15.9、12.6、10.0、7.95、6.3、5.0 mg／mL 的牛蒡苷元溶液，灌胃前充分搖勻。

0.5%羧甲基纖維素鈉的配制：準確稱取0.5 g羧甲基纖維素鈉，溶解于100 mL蒸餾水中，保存于4℃冰箱內(nèi)，限7 d內(nèi)使用。

牛蒡子提取物的配制：準確稱取牛蒡子提取物15.0 g，溶解于50 mL的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，配成均勻混懸液，濃度為 0.3 g／mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，灌胃前充分搖勻。

1.4 試驗動物 SPF級昆明種小鼠，120只，雌雄各半，3～4周齡，體重18～22 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2008-0005。小鼠購買后在實驗室動物房內(nèi)預飼養(yǎng)一周，飼料為全價營養(yǎng)顆粒飼料。

實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2014-0081。整個試驗過程中保持室內(nèi)清潔衛(wèi)生，空氣流通。小鼠每籠5只，雌雄分開，自由飲水、采食。室溫控制在20～25℃，相對濕度40% ～70%，照明采用12 h／12 h晝夜明暗交替，每周更換2次墊料。

2 方 法

2.1 動物分組與劑量設計

2.2.1 牛蒡苷元實驗組 根據(jù)預試驗的結(jié)果，將80只昆明小鼠隨機分成8組，每組10只，雌雄各半。設置7個給藥組及1個空白對照組，給藥組劑量分別為 400、318、252、200、159、126、100、0 mg／kg.bw。

2.1.2 牛蒡子提取物實驗組 根據(jù)急性毒性預試驗的結(jié)果，沒有出現(xiàn)小鼠死亡的情況，故進行最大耐受量（MTD）的測定。將40只昆明小鼠隨機分成2組，為給藥組和溶媒對照組，每組20只，雌雄各半。按照牛蒡子提取物能溶解的最大濃度0.3 g／mL（同時藥液能通過灌胃針管），小鼠的最大灌胃給藥體積0.4 mL／10 g.bw 給藥，24 h 內(nèi)灌胃 3 次，3 次累計給予 1.2 mL／10 g.bw，相當于牛蒡子提取物36 g／kg.bw，作為給藥組。溶媒對照組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

2.2 給藥

2.2.1 牛蒡苷元實驗組 給藥前12～16 h動物禁食不禁水，牛蒡苷元實驗各組均按照0.2 mL／10 g.bw的給藥體積進行一次性灌胃給藥；給藥后2 h給予飼料，自由飲水。

2.2.2 牛蒡子提取物實驗組 給藥組小鼠灌胃給予牛蒡子提取物藥液（0.3 g／mL，0.4 mL／10 g.bw），抽取藥液時始終進行攪拌，溶媒對照組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，首次給藥后2 h給予飼料，自由飲水。24 h內(nèi)給藥3次，每次間隔時間6 h。

2.3 試驗結(jié)果觀察

2.3.1 牛蒡苷元實驗組 給藥后仔細觀察和詳細記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應癥狀及開始和消失時間，記錄小鼠的死亡數(shù)目及死亡時間。對小鼠進行灌胃給藥后連續(xù)觀察8 h，以后每天觀察記錄2次，連續(xù)觀察14 d。觀察并記錄小鼠毛色、眼睛、分泌物、排泄物、呼吸、自主活動與中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為等的變化情況以及小鼠死亡時間和死亡表現(xiàn)，對所有死亡或處死小鼠進行尸檢。

2.3.2 牛蒡子提取物實驗組 3次給藥間隔期間連續(xù)觀察小鼠的反應，最后一次給藥后再連續(xù)觀察4～6 h，以后每天觀察記錄2次，連續(xù)觀察14 d。詳細觀察并記錄小鼠給藥后的反應，包括：神經(jīng)系統(tǒng)方面：行為及反應（姿勢變化、不正常叫聲、煩躁不安、呆滯等）、運動（肌肉抽搐、運動失調(diào)、強迫運動、僵硬等）、瞳孔及分泌物（瞳孔有無縮小或放大、流淚、流涎等）。呼吸及心血管方面：呼吸急促或過緩、心跳過強或過弱、流鼻涕等。胃腸方面：腹部氣脹或收縮，腹瀉或便秘等。泌尿生殖系統(tǒng)方面：陰戶、乳腺腫脹、會陰部污穢等。皮膚和被毛方面：顏色、張力、完整性、有無發(fā)紅、皮疹等。黏膜和眼方面：有無充血、出血、黏液、眼球突出、震顫或渾濁等。

于給藥前和給藥最后一天對小鼠稱重，并記錄。詳細記錄小鼠出現(xiàn)毒性反應的癥狀、起始時間、嚴重程度、持續(xù)時間等，記錄小鼠死亡數(shù)目及死亡時間。在實驗結(jié)束時對所有小鼠進行大體解剖，肉眼觀察各個器官有無異常，并與對照組進行比較，當組織器官出現(xiàn)顏色、質(zhì)地、體積等改變時，均應記錄并進行組織病理學檢查，初步判斷可能的毒性靶器官。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，以“平均數(shù)±標準差”表示各劑量組動物體重，進行方差分析，并按動物性別分別統(tǒng)計。

3 結(jié)果與分析

3.1 牛蒡苷元實驗組 小鼠在給藥后15 min內(nèi)出現(xiàn)明顯毒性反應，表現(xiàn)為心跳加快、興奮、狂躁、驚厥、運動失調(diào)等，在出現(xiàn)角弓反張的掙扎后迅速死亡，如圖1。小鼠死亡主要發(fā)生在給藥后12 h內(nèi)，1 d后存活小鼠恢復正常。剖檢死亡小鼠，胃內(nèi)充滿淡黃色液體，其他臟器未見異常，如圖2。給藥后死亡數(shù)量見表1。

根據(jù)簡化蔻氏LD50計算方法：

圖1 死亡結(jié)果Fig 1 Death result

圖2 解剖結(jié)果Fig 2 Anatomical result

表1 牛蒡苷元灌胃給藥后急性毒性死亡數(shù)量Tab 1 Acute oral toxicity test of arctigenin in mice

牛蒡苷元急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果表明：小鼠灌胃給予牛蒡苷元的半數(shù)致死量為219.8 mg／kg，死亡均發(fā)生在3 h以內(nèi)，存活動物均正常生長。依據(jù)獸藥指導原則急性毒性分級評價標準規(guī)定，牛蒡苷元屬中等毒級。

3.2 牛蒡子提取物實驗組 給藥間隔期間和14 d觀察期內(nèi)，各組小鼠精神狀況良好，行為活動正常，皮膚和被毛清潔，大小便正常，無異常分泌物，亦未見其他中毒反應癥狀。至試驗結(jié)束時小鼠沒有出現(xiàn)死亡情況。

小鼠體重增長正常，給藥組與溶媒對照組比較，體重變化差異不顯著（P＞0.05）。試驗結(jié)束時對小鼠進行大體解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，均無異常變化。試驗結(jié)果見表3。

表2 采用簡化寇氏法計算小鼠口服牛蒡苷元的LD50及置信區(qū)間Tab 2 Using the simplified Karber＇s method calculation of mice orally arctigenin LD50 and confidence interval

表3 牛蒡子提取物小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果（S.D）Tab 3 Acute oral toxicity test of Arctii Fructus powder in mice（S.D）

表3 牛蒡子提取物小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果（S.D）Tab 3 Acute oral toxicity test of Arctii Fructus powder in mice（S.D）

注：給藥組與空白組比較，P＞0.05Note：Give medicine group compared with the control group， P ＞0.05

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采用最大耐受量法（MTD）進行測定牛蒡子提取物急性毒性試驗結(jié)果表明：牛蒡子提取物的最大藥物濃度0.3 g／mL，小鼠的最大灌胃體積0.4 mL／10 g.bw，24 h內(nèi)進行3次灌胃給藥，小鼠在14 d觀察期內(nèi)均沒有出現(xiàn)明顯中毒癥狀及死亡情況，得出該樣品的MTD值≥36 g／kg.bw，依據(jù)獸藥指導原則急性毒性分級評價標準規(guī)定，該提取物屬實際無毒級［7］。

4 討論與結(jié)論

急性毒性試驗是對動物進行1次給藥或在24 h內(nèi)進行2～3次給藥，通過觀察動物的中毒癥狀及死亡情況等指標來判斷毒性反應的性質(zhì)和程度，評價藥物的毒性大小的試驗。在新藥研發(fā)過程中，通常要進行急性毒性研究，所得到的結(jié)果可以初步探索藥物毒性作用大小和靶器官，并為其他毒性試驗的劑量設計提供參考。本試驗采用昆明種小鼠進行牛蒡苷元和牛蒡子提取物經(jīng)口給藥的急性毒性試驗。

牛蒡苷元預試驗過程中，100%致死劑量為400 mg／kg，0%致死劑量為100 mg／kg，確定Ⅳ為7，r為 1.26，因此確定各組劑量分別為 400、318、252、200、159、126、100 mg／kg.bw。 試驗結(jié)果表明，小鼠灌胃給予牛蒡苷元的半數(shù)致死量為219.8 mg／kg，死亡均發(fā)生在3 h以內(nèi)，存活動物均正常生長，根據(jù)小鼠死亡時間和死亡特征，推測牛蒡苷元具有一定的神經(jīng)毒性，依據(jù)獸藥指導原則急性毒性分級評價標準規(guī)定，牛蒡苷元屬中等毒級。牛蒡苷元較一般中草藥及中草藥提取物急性毒性大，雙黃連口服液對小白鼠最小致死量范圍為49.2～60.8 g／kg，根據(jù)中藥毒性分級可判斷雙黃連口服液為小毒［8］；中藥復方制劑“歸芪飲”灌服給藥的LD50為22.44 g／kg，按照毒理學評價標準，LD50大于10000 mg／kg即屬于無毒性物質(zhì)，從而表明中藥復方制劑“歸芪飲”安全無毒［9］；銀黃連翹散急性毒性試驗中，兩次重復試驗 LD50大于 5000 mg／kg，屬實際無毒［10］；這表明牛蒡苷元在獸醫(yī)臨床使用中需要注意其急性毒性所帶來的危害。

在進行牛蒡子提取物預試驗過程中，分別以36、18、9 g／kg.bw 的劑量進行灌胃給藥，結(jié)果各劑量組小鼠均未出現(xiàn)死亡情況，且沒有表現(xiàn)出毒性癥狀，說明牛蒡子粉的毒性低，無法進行LD50的測定。故采用最大耐受量法，以預試驗的最大劑量36 g／kg.bw（即牛蒡子粉的最大藥物濃度 0.3 g／mL，小鼠的最大灌胃體積 0.4 mL／10g.bw，24 h 內(nèi)灌胃3 次，3 次累計給予1.2 mL／10 g.bw）作為給藥劑量進行灌胃給藥，在此劑量下，小鼠生長狀況良好，無任何明顯中毒癥狀及死亡情況，小鼠體重增長正常，給藥組與對照組相比無顯著性差異。試驗結(jié)束時對小鼠進行大體解剖，各臟器均無形態(tài)及顏色異常。試驗結(jié)果為：雌雄小鼠急性經(jīng)口MTD均≥36 g／kg.bw，根據(jù)獸藥研究技術指導原則對急性經(jīng)口毒性試驗的分級標準，牛蒡子粉為實際無毒級，這一研究結(jié)果符合中草藥綠色、安全的特性，提示其在獸醫(yī)臨床中可長期使用。根據(jù)急性毒性試驗的結(jié)果，可初步評價牛蒡子粉在短期內(nèi)用藥比較安全，為了進一步評價藥物的安全性，還需要對其進行長期毒性研究。