劉 寧，趙 佳，武選民，同紅娟，代春吉，常大偉，李 超

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安710021； 2.西安風(fēng)吹麥浪農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)開發(fā)有限公司，西安710003； 3.楊凌子蘇生物科技有限公司，陜西 楊凌712100)

植物蛋白具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量大、資源豐富等優(yōu)點，越來越多的科研工作者把尋找和開拓新的蛋白質(zhì)資源及提高蛋白質(zhì)利用率和附加值作為研究重點[1]。紫蘇在我國種植廣泛，是傳統(tǒng)的藥食兩用植物資源。紫蘇籽粕是紫蘇籽提油后的副產(chǎn)品，其中蛋白質(zhì)含量高且雜質(zhì)少，氣味良好且無毒無害，是良好的蛋白質(zhì)來源。目前，紫蘇籽粕僅作為動物飼料或充當(dāng)肥料等，其自身價值未能得到充分利用[2]，在高值化利用方面有一定的不足，因此紫蘇籽粕具有良好的開發(fā)前景。

謝超等[3]研究了等電點法提取紫蘇籽蛋白的最佳工藝條件，最終獲得純度為88.81%(干基)的紫蘇籽蛋白。盛彩虹等[4]以大豆分離蛋白為對照，研究了紫蘇分離蛋白的功能性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)紫蘇分離蛋白的乳化穩(wěn)定性與大豆分離蛋白相當(dāng)。目前，學(xué)者們的研究多集中在紫蘇籽蛋白的提取工藝，或其中某一種蛋白組分的功能性質(zhì)，關(guān)于紫蘇籽中不同蛋白組分的功能性質(zhì)差異研究較少[5]。本文采用堿溶酸沉法提取紫蘇籽分離蛋白以及Osborne分級法提取紫蘇籽清蛋白、球蛋白，并對3種蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)進行研究，以期為紫蘇資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紫蘇籽，西安風(fēng)吹麥浪農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)開發(fā)有限公司；大豆油，中糧集團食品有限公司；甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、四甲基乙二胺，生工生物工程有限公司；考馬斯亮藍R-250，美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

K9840凱氏定氮儀，Membrapure A-300氨基酸分析儀，F(xiàn)YY-6D電泳儀，Q2000差示掃描量熱儀，F(xiàn)A25高剪切分散乳化機，UV-VS 2501PC紫外-可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫蘇籽脫脂粉的制備

將紫蘇籽用研磨機粉碎，過60目篩，取一定量紫蘇籽粉于燒杯中，加入3倍質(zhì)量的石油醚(沸程60～90℃)在室溫下攪拌30 min，提取2次，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去石油醚，置于通風(fēng)櫥揮干，得紫蘇籽脫脂粉，過80目篩，收集備用。

1.2.2 紫蘇籽及其脫脂粉的成分測定

粗蛋白質(zhì)含量、粗脂肪含量、粗纖維含量、水分含量和灰分含量的測定分別參照GB 5009.5—2016、GB 5009.6—2016、GB/T 6434—2006、GB 5009.3—2016、GB 5009.4—2016進行。

1.2.3 紫蘇籽不同蛋白組分的提取

取一定量紫蘇籽脫脂粉與去離子水按料液比1∶20 混合，用2 mol/L NaOH調(diào)pH至9，于50℃下攪拌1 h后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液，用2 mol/L HCl將上清液的pH調(diào)至4。以8 000 r/min離心5 min，取沉淀用去離子水洗滌3次。用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至中性，凍干后即得紫蘇籽分離蛋白。

清蛋白和球蛋白采用Osborne分級法提取[6]。將紫蘇籽脫脂粉與去離子水按料液比1∶12混合后充分攪拌2 h，于4℃下以10 000 r/min離心30 min，重復(fù)提取2次取上清液(沉淀收集用于提取球蛋白)。將上清液pH調(diào)為4，靜置30 min，于4℃下以10 000 r/min離心15 min，取沉淀復(fù)溶調(diào)pH至中性，透析2 d，凍干得紫蘇籽清蛋白。將清蛋白提取時收集的沉淀用2%的NaCl溶液按料液比1∶12混合攪拌2 h，于4℃下以10 000 r/min離心15 min，重復(fù)提取2次合并上清液，用HCl將上清液pH調(diào)為4，靜置30 min，于4℃下以10 000 r/min離心15 min，取沉淀復(fù)溶，調(diào)pH至中性，透析2 d后凍干，即得紫蘇籽球蛋白。由于常見植物種子中清蛋白、球蛋白功能特性較好[7]，因此本文不再提取醇溶蛋白、谷蛋白。

1.2.4 不同蛋白的氨基酸組成分析

分別稱取一定量的蛋白粉于水解管中，加入5 mL 6 mmol/L的HCl，在110℃烘箱中水解24 h后冷卻，加去離子水定容到25 mL。取1 mL水解液于小燒杯中，在60℃烘箱中脫酸后加入1 mL檸檬酸鈉緩沖液(pH 2.2)，過0.22 μm的濾膜，利用Membrapure A-300氨基酸分析儀測定紫蘇籽蛋白的氨基酸組成[8](色氨酸經(jīng)堿水解后測定)。

1.2.5 SDS-PAGE電泳測定

根據(jù)Laemmli[9]的方法，電泳用濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%，分離膠質(zhì)量分數(shù)為12%，用0.025 mmol/L Tris-Gly緩沖液溶解蛋白樣品，取10 μL樣品加入到每個孔中。用0.1%的考馬斯亮藍R-250染液染色180 min，洗脫液為甲醇-冰醋酸-水(體積比1∶1∶8)，洗脫4次。所得結(jié)果與Marker進行對照分析。

1.2.6 差示掃描量熱法(DSC)圖譜分析

準確稱取2 mg蛋白樣品，置于空鋁盤中，加入10 μL蒸餾水后密封。用一個空鋁盤作為對照，參數(shù)設(shè)置為：溫度掃描范圍0～155℃，升溫速率6℃/min，氮氣流速55 mL/min[10]。

1.2.7 不同蛋白的持水性及持油性測定

1.2.7.1 持水性的測定

稱取1.0 g蛋白樣品置于50 mL離心管中，向離心管中加入30 mL pH為7的去離子水，在常溫下攪拌1.5 h，以8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，記錄沉淀與離心管的總質(zhì)量，按下式計算每克樣品對水的保持量。

式中：m0為蛋白樣品的質(zhì)量，g；m1為離心管質(zhì)量，g；m2為吸水后蛋白及離心管的總質(zhì)量，g。持水性單位最后換算成mL/g。

1.2.7.2 持油性的測定

稱取1.0 g蛋白樣品置于50 mL離心管中，向離心管中加入20 mL食用大豆油，攪拌2 min，在常溫下靜置30 min后，以2 000 r/min離心10 min，記錄吸油后蛋白與離心管總質(zhì)量，按下式計算每克樣品對油的保持量。

式中：m0為蛋白樣品的質(zhì)量，g；m1為離心管的質(zhì)量，g；m2為吸油后蛋白與離心管總質(zhì)量，g。持油性單位最后換算成mL/g。

1.2.8 不同蛋白的溶解性測定

根據(jù)Aluko等[11]的方法進行測定。取0.5 g蛋白樣品與50 mL去離子水混合均勻，將蛋白分散液的pH調(diào)為1～10，在常溫下攪拌1.5 h后，以6 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，定容到100 mL容量瓶中。用凱氏定氮法測定上清液中蛋白質(zhì)含量，按下式計算蛋白溶解性。

溶解性=W2/W1×100%

式中：W1為原樣品中粗蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；W2為上清液中粗蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.2.9 不同蛋白的乳化活性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)測定

分別配制2%的蛋白溶液，將溶液pH調(diào)節(jié)為2～9，將大豆油和上述蛋白溶液按1∶3混合均勻，以20 000 r/min均質(zhì)1 min，量取均質(zhì)后的乳液50 μL，用0.1% SDS稀釋100倍后于500 nm處測定吸光度[12]。按下式計算EAI和ESI。

式中：EAI為乳化活性，m2/g ;DF為乳液稀釋倍數(shù)，本實驗中DF=100；C為蛋白質(zhì)量濃度，g/mL；?為光程，?=0.01 m；θ為油相體積分數(shù)，θ=0.25；ESI為乳化穩(wěn)定性，min；A0、A10分別為均質(zhì)后0 min和10 min時的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫蘇籽及其脫脂粉的成分(見表1)

表1 紫蘇籽及其脫脂粉的成分 %

由表1可知，紫蘇籽中粗脂肪含量較高，達48.36%，粗蛋白質(zhì)和粗纖維含量分別為23.30%和26.32%，而紫蘇籽脫脂粉中含有較多的粗蛋白質(zhì)，含量達39.85%，表明紫蘇籽脫脂粉是良好的植物蛋白資源。

2.2 不同蛋白組分的得率

實驗采用不同方法提取紫蘇籽脫脂粉中的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫蘇籽脫脂粉中蛋白質(zhì)含量豐富，經(jīng)堿溶酸沉法提取，分離蛋白的得率為34.75%。分級提取的清蛋白和球蛋白得率分別為12.52%和20.85%。

2.3 氨基酸組成(見表2)

表2 不同紫蘇籽蛋白的氨基酸組成及含量 %

注：*表示必需氨基酸。

由表2可知，紫蘇籽蛋白的氨基酸組成豐富，3種蛋白中必需氨基酸種類齊全，谷氨酸和精氨酸含量均較高。因此，攝入紫蘇籽蛋白可以滿足人體對必需氨基酸的需求，紫蘇籽蛋白是一種優(yōu)良的植物蛋白資源。

2.4 SDS-PAGE圖譜(見圖1)

圖1 不同紫蘇籽蛋白的SDS-PAGE圖譜

由圖1可知，紫蘇籽蛋白的SDS-PAGE圖譜中均有多條清晰可見的條帶，表明紫蘇籽蛋白由多個亞基組成。清蛋白與球蛋白具有相似的條帶分布，電泳圖譜包含4條清晰可見的條帶，相對分子質(zhì)量分別為45、25、20 kDa和5～10 kDa。分離蛋白的電泳圖譜與清蛋白、球蛋白的稍有區(qū)別，清晰可見相對分子質(zhì)量范圍分別為25～36 kDa和15～20 kDa的兩個條帶，這可能由于分離蛋白采用堿溶酸沉法提取，相比清蛋白、球蛋白提取時的pH更高，能夠溶出更大相對分子質(zhì)量的蛋白組分。

2.5 DSC圖譜(見圖2)

圖2 不同紫蘇籽蛋白的DSC圖譜

由圖2可知，不同紫蘇籽蛋白的DSC圖譜均只有一個光滑的吸熱峰，表明這3種蛋白組分純度較高，其吸收峰均呈向內(nèi)凹陷的單吸熱峰[13]。不同紫蘇籽蛋白的熱學(xué)特性見表3。

表3 不同紫蘇籽蛋白的熱學(xué)特性

由表3可知：紫蘇籽清蛋白、球蛋白和分離蛋白的熱變性溫度Td相近，分別為107.36 、104.58℃和107.45℃；與其他兩種蛋白相比，球蛋白的Td較低。半峰寬ΔTd主要反映蛋白在熱變性過程中的協(xié)同性[14]，清蛋白的ΔTd小于其他兩種蛋白，表明清蛋白更易在較窄的溫度范圍發(fā)生完全變性[12]，而分離蛋白完全變性所需的溫度范圍更寬。

2.6 不同蛋白的持水性及持油性(見圖3)

圖3 不同紫蘇籽蛋白的持水性、持油性

由圖3可知，紫蘇籽清蛋白具有較高的持水性和持油性，分別為3.63 mL/g和3.72 mL/g，球蛋白和分離蛋白持水性分別為2.36 mL/g和2.79 mL/g。蛋白顆粒與水接觸后，會發(fā)生吸水溶脹，有報道稱適合做黏性食品的蛋白持水性處于1.49～4.72 mL/g范圍內(nèi)[15]。持油性對蛋白具有實際應(yīng)用價值，球蛋白和分離蛋白的持油性分別為2.93 mL/g和3.14 mL/g，而清蛋白的持油性最高，這可能是因為其分子結(jié)構(gòu)更加開放[5]。

2.7 不同蛋白的溶解性(見圖4)

圖4 不同紫蘇籽蛋白的溶解性

由圖4可知，3種蛋白的溶解性變化趨勢較一致，均呈現(xiàn)出U型的溶解性曲線。當(dāng)pH在等電點附近時，蛋白的溶解性都較低；當(dāng)pH偏離等電點較遠時，蛋白的溶解性均逐漸增大。不同蛋白中，溶解性高低順序依次為球蛋白、清蛋白、分離蛋白；球蛋白溶解性高于其他兩種蛋白，在pH為10時達到最高，為85.3%。

2.8 不同蛋白的乳化活性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)(見圖5)

由圖5可知，紫蘇籽蛋白的乳化活性與乳化穩(wěn)定性曲線都表現(xiàn)出U型趨勢。當(dāng)pH為4時，3種蛋白的EAI和ESI均最低，清蛋白分別為26.1 m2/g和19.7 min，球蛋白分別為25.3 m2/g和16.6 min，分離蛋白分別為23.2 m2/g和7.1 min。當(dāng)pH為9時，3種蛋白的EAI和ESI均最高。同時，當(dāng)pH偏離等電點時，3種蛋白的EAI及ESI均表現(xiàn)出增加趨勢。這與姜文鑫等[5]的研究結(jié)果較為相近。

圖5 不同紫蘇籽蛋白的乳化活性與乳化穩(wěn)定性

3 結(jié) 論

本研究采用堿溶酸沉法和Osborne分級法提取了紫蘇籽中分離蛋白、清蛋白和球蛋白，并研究了其功能性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：紫蘇籽脫脂粉中蛋白質(zhì)含量豐富，3種蛋白中谷氨酸、精氨酸含量較高，均含有8種必需氨基酸；清蛋白和球蛋白的亞基組成相近，分離蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性；清蛋白的持水性和持油性高于其他兩種蛋白；在pH 1～10范圍內(nèi)，3種蛋白的溶解性均呈現(xiàn)出U型變化趨勢，其中球蛋白的溶解性最好；在pH 2～9范圍內(nèi)，球蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性均優(yōu)于其他兩種蛋白。