周祖蓮， 趙通武， 李玉華， 冉思成， 姜安雅

(重慶市黔江中心醫(yī)院腎內(nèi)科， 重慶 409099)

免疫球蛋白A腎病(IgA nephropathy，IgAN)是慢性腎疾病和腎衰竭的主要因素之一[1]，同時(shí)也是原發(fā)性腎小球疾病中最常見的一種疾病類型[2]。在中國(guó)，IgAN病人在20年內(nèi)發(fā)展為腎衰竭的比例高達(dá)36%[3]。同時(shí)，患有未知原發(fā)性腎疾病的患者在腎移植后會(huì)出現(xiàn)IgAN并發(fā)癥[4]。因此，深入探討IgAN發(fā)病機(jī)理，對(duì)IgAN及其相關(guān)疾病現(xiàn)有的治療手段的補(bǔ)充和擴(kuò)展具有重要的臨床意義。

免疫系統(tǒng)的激活以及炎癥反應(yīng)是包括IgAN在內(nèi)的慢性腎疾病的主要病因之一[5]。IgAN最核心的致病因素即為循環(huán)中以半乳糖缺乏的IgA為主的免疫復(fù)合物形成后沉積于腎小球系膜區(qū)域，從而導(dǎo)致系膜機(jī)制擴(kuò)張和腎小球纖維化[6]。臨床觀察顯示IgAN患者中通常存在半乳糖缺乏的IgA和IgA復(fù)合物的增加，這種現(xiàn)象部分可以歸結(jié)為B細(xì)胞過度產(chǎn)生IgA所致[7-8]；除此之外，也有報(bào)道顯示IgA和IgA復(fù)合物的清除障礙也是原因之一[9]。但是，關(guān)于誘發(fā)IgA產(chǎn)生的因素以及IgA的產(chǎn)生部位至今還不明確，因此，現(xiàn)在依然沒有特異性針對(duì)這種病理因素的治療手段來干預(yù)該疾病的發(fā)生與發(fā)展[5, 10]。面對(duì)這種現(xiàn)狀，需要我們對(duì)其發(fā)病機(jī)理以及干預(yù)手段進(jìn)行更深入的了解。

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號(hào)通路在IgAN的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色[11]。最近研究發(fā)現(xiàn)匹多莫德(pidotimod)可以抑制TLR信號(hào)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。匹多莫德是一個(gè)人工合成的二肽小分子，在動(dòng)物和人類樣本中的研究都發(fā)現(xiàn)它對(duì)固有免疫以及適應(yīng)性免疫具有廣泛的調(diào)節(jié)作用[13]。因此，本研究中我們探討匹多莫德是否可能通過抑制炎癥反應(yīng)影響IgAN的進(jìn)程，從而為IgAN的治療提供更多的臨床前實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

牛丙種球蛋白(bovine gamma globulin,BGG)購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司；RNAiso Plus試劑購(gòu)于TaKaRa；抗IgA抗體購(gòu)于Southern Biotech；蛋白裂解液購(gòu)于江蘇碧云天生物公司；BCA蛋白定量試劑盒及抗白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-6抗體購(gòu)買于Thermo Fisher Scientific；實(shí)驗(yàn)用引物由上海吉瑪公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和IgAN模型的制作與分組 40只6周齡，SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重為180～200 g，購(gòu)自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK(瀘)2017-0005。4只用于預(yù)實(shí)驗(yàn)IgAN大鼠模型練習(xí)，不納入實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。36只SD大鼠，隨機(jī)均分為正常對(duì)照(control)組、模型(model)組、強(qiáng)的松(prednisone)組和匹多莫德(pidotimod)組，每組9只。IgAN大鼠模型制造方法參考文獻(xiàn)[14]，大鼠連續(xù)給予含有0.1% BGG的6 mmol/L HCl溶液作為飲用水。8周后，大鼠連續(xù)3 d尾靜脈注射給予1 mg BGG(溶解于6 mol/L HCl溶液)。正常對(duì)照組不做任何處理，給予自由飲水和食物；模型組在IgAN模型制作后，給予自由飲水和食物；強(qiáng)的松組的IgAN模型大鼠按照10 mg·kg-1·d-1的劑量進(jìn)行灌胃作為陽性對(duì)照組；在匹多莫德組，以無菌蒸餾水配制匹多莫德溶液，按10 mg·kg-1·d-1的劑量對(duì)IgAN模型大鼠進(jìn)行腹腔注射。以上各處理組的治療時(shí)間均為4周。處理結(jié)束后采集樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2樣品采集和腎功能生化指標(biāo)的分析 將各處理組大鼠在12周末放置于代謝籠中收集24 h內(nèi)尿液，同時(shí)進(jìn)行股動(dòng)脈采集血樣；樣本均保存于-20 ℃。血清肌酐、尿蛋白和血尿素氮等指標(biāo)使用Beckman自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.3RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、纖連蛋白1(fibronectin 1)、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平 取0.1 g腎皮質(zhì)區(qū)樣本置于勻漿器內(nèi)，加入1 mL RNAiso Plus試劑(TaKaRa，貨號(hào)9108)，勻漿后置于1.5 mL離心管中，按照試劑說明書提取總RNA。以50 μL DEPC水溶解后利用NanoDrop 2000測(cè)定RNA濃度。以1 μg RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。將獲得的cDNA按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作以檢測(cè)各基因表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)參照，按照2-ΔΔCt法計(jì)算相應(yīng)基因的表達(dá)量。該實(shí)驗(yàn)使用引物序列見表1。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)所使用引物

2.4免疫熒光檢測(cè)腎組織內(nèi)IgA的沉積 各處理組腎組織經(jīng)過石蠟包埋切片，組織樣本厚度大約為4 μm。利用二甲苯脫蠟2次，每次10 min。之后依次使用無水乙醇-95%乙醇-80%乙醇-70%乙醇-ddH2O-ddH2O-ddH2O進(jìn)行復(fù)水，每次3 min。最后利用0.3%H2O2處理切片10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。經(jīng)過抗原修復(fù)冷卻至室溫后，利用FITC標(biāo)記的IgA抗體4 ℃孵育過夜，次日經(jīng)洗滌后利用尼康激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像。

2.5Western blot檢測(cè) IL-1β和IL-6蛋白在腎組織的表達(dá)水平 利用蛋白質(zhì)裂解液從各處理組腎皮質(zhì)區(qū)提取總蛋白質(zhì)。按照BCA試劑盒說明書對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。取50 μg蛋白質(zhì)樣品，加入上樣緩沖液后在沸水中煮5 min以使蛋白質(zhì)充分變性。15% SDS-PAGE分離目的蛋白質(zhì)，之后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入稀釋過后的I抗4 ℃孵育過夜，次日經(jīng)過TBST洗滌后加入相應(yīng)II抗室溫孵育1 h。再次洗滌后利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影成像。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)定量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)進(jìn)行描述，并使用軟件GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。對(duì)于多組定量資料的比較采用單因素方差方法進(jìn)行分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 匹多莫德對(duì)IgAN模型大鼠腎功能的影響

各處理組大鼠在12周末時(shí)進(jìn)行體重和一般腎功能生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果顯示，4組大鼠體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1A。在IgAN模型組大鼠中尿蛋白、血清肌酐和血尿素氮升高(P<0.01)；相對(duì)于模型組，給予強(qiáng)的松或者匹多莫德治療后大鼠的尿蛋白、血清肌酐和血尿素氮均顯著降低(P<0.01)，見圖1B～D。

Figure 1. The effect of pidotimod on the body weight and biochemical indicators of the rats in different treatment groups. A: no significant difference of the body weight was observed in the 4 groups; B, C and D: pidotimod reversed the increased levels of urine protein, serum creatinine and blood urea nitrogen in the IgAN rats. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖1 匹多莫德對(duì)IgAN模型大鼠體重和生化指標(biāo)的影響

2 匹多莫德對(duì)IgAN模型大鼠腎組織中IgA沉積的影響

組織免疫熒光法對(duì)IgA的沉積進(jìn)行觀察的結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組只有極少量IgA沉積，而IgAN模型大鼠腎組織中IgA沉積顯著增多(P<0.01)，但給予強(qiáng)的松或者匹多莫德治療后，IgA沉積明顯減少(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. Pidotimod inhibited IgA deposition in the IgAN rats (×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖2 匹多莫德抑制IgAN模型大鼠腎組織中IgA沉積

3 匹多莫德對(duì)IgAN模型大鼠腎纖維化的影響

用RT-qPCR方法對(duì)各處理組腎組織中纖維化標(biāo)志物TGF-β1和fibronectin 1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在IgAN模型組，TGF-β1和fibronectin 1的mRNA表達(dá)水平分別較正常對(duì)照組顯著增多(P<0.01)；而在強(qiáng)的松或者匹多莫德治療組，兩者的表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01),見圖3。這一結(jié)果提示匹多莫德可以有效緩解IgAN的病理發(fā)展。

Figure 3. Pidotimod alleviated renal fibrosis in the IgAN rats. The expression levels of renal fibrosis markers were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖3 匹多莫德抑制IgAN模型大鼠腎組織中纖維化標(biāo)志物TGF-β1和fibronectin 1的mRNA表達(dá)水平

4 匹多莫德對(duì)IgAN模型大鼠腎組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

提取各個(gè)處理組腎組織樣品，分別對(duì)IL-1β和IL-6在mRNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，IgAN模型組大鼠的IL-1β和IL-6表達(dá)在mRNA和蛋白水平均明顯增加，且和正常對(duì)照組的表達(dá)量相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而強(qiáng)的松或者匹多莫德治療4周后均可以抑制上述炎性細(xì)胞因子在mRNA和蛋白水平的表達(dá)(P<0.01)，見圖4。這一結(jié)果提示匹多莫德可以通過調(diào)控炎癥反應(yīng)減輕IgAN癥狀。

Figure 4. Pidotimod inhibited the production of IL-1β and IL-6 both at mRNA (A) and protein (B) levels. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖4 匹多莫德抑制IgAN模型大鼠腎組織中炎性細(xì)胞因子 IL-1β和IL-6的表達(dá)

討 論

本研究中匹多莫德可以有效改善IgAN模型大鼠的病理癥狀，比如減少蛋白尿的產(chǎn)生，抑制IgA的沉積，阻礙腎纖維化的進(jìn)程。本研究的發(fā)現(xiàn)為匹多莫德應(yīng)用于IgAN的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為IgAN患者能夠持續(xù)使用免疫抑制劑提供了一定的依據(jù)。

大量研究表明炎癥反應(yīng)在IgAN的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色[15]。IgAN患者中常伴有C-反應(yīng)蛋白等炎性標(biāo)志物的增加。且有證據(jù)表明在IgAN患者中IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子的增加與病患的預(yù)后密切相關(guān)[16-17]。我們的研究發(fā)現(xiàn)IgAN模型大鼠腎皮質(zhì)區(qū)域IL-1β與IL-6的表達(dá)在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均有增加；而在給予匹多莫德治療后，可以抑制IgAN誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的表達(dá)。我們的研究初步表明匹多莫德對(duì)IgAN的保護(hù)作用可能是通過抑制炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的。

匹多莫德自從被發(fā)現(xiàn)以來在臨床中的應(yīng)用一直集中于對(duì)兒童急性呼吸道感染疾病的防治中；且最近的臨床試驗(yàn)表明匹多莫德對(duì)于兒童反復(fù)呼吸道感染也具有一定的療效[18]。鑒于匹多莫德對(duì)固有免疫和適應(yīng)性免疫的多重作用，它是否通過其他途徑影響了IgA腎病的病理進(jìn)展有待我們進(jìn)一步分析?？偠灾?，我們發(fā)現(xiàn)匹多莫德可以通過抑制IL-1β與IL-6促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，降低纖維化標(biāo)志物TGF-β1和fibronectin 1的表達(dá)，從而減緩IgA腎病的發(fā)展，從而為IgA腎病的臨床治療提供可能的新型治療方法，也為豐富匹多莫德的臨床使用提供了一定的理論基礎(chǔ)。