陳 芳， 鄒聯(lián)洪， 劉協(xié)紅， 袁李禮， 蔣 宇△

(1湖南省人民醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)研究所， 急危重癥代謝組學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長沙 410005； 2湖南省腦科醫(yī)院心血管內(nèi)科， 湖南 長沙 410007)

阿霉素(adriamycin; 又稱多柔比星，doxorubicin，DOX)作為一種廣譜蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體腫瘤的化療[1]。雖然DOX的臨床療效確切，但臨床應(yīng)用受限于其劑量依賴性心肌細(xì)胞毒性損傷[2]，探討相關(guān)分子機(jī)制有利于尋找合適的心肌細(xì)胞保護(hù)策略。DOX引發(fā)的自由基形成是導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的重要原因，自由基的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，氧化應(yīng)激損傷能夠?qū)е滦募〖?xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變[3]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，NRF2)是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，通過抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)調(diào)控抗氧化基因表達(dá)，增加細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抗性[4]。研究報(bào)道NRF2缺乏加重阿霉素所致心肌毒性和損傷[5]。溶酶體作為細(xì)胞中一類細(xì)胞器，富含多種水解酶，控制多種內(nèi)外源性大分子物質(zhì)的降解[6]，溶酶體功能失調(diào)和氧化應(yīng)激常能互相調(diào)控和影響，互為因果。NRF2拮抗阿霉素心肌細(xì)胞損傷是否與調(diào)控溶酶體有關(guān)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬采用DOX處理大鼠心肌 H9C2細(xì)胞損傷模型，探討NRF2對H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和溶酶體功能障礙的影響，為明確阿霉素心肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料和儀器

大鼠心肌H9C2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰酶、雙抗和 DMSO購自Gibco；PrimeScriptTMRT reagent Kit和TB Green? Premix Ex TaqTM購自大連寶生物有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；NRF2過表達(dá)慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；FITC-dextran購自Sigma；抗NRF2、溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1)和組織蛋白酶B(cathepsin B)抗體購自Abcam。CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；熒光定量PCR儀(ABI)；倒置熒光顯微鏡(Olympus)；酶標(biāo)儀(BioTek)；蛋白電泳分離、轉(zhuǎn)膜和成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和模型構(gòu)建 大鼠心肌H9C2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。細(xì)胞生長至80%～90%融合度時(shí)傳代，取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。用DOX處理H9C2細(xì)胞構(gòu)建損傷模型，DOX終濃度為5 μmol/L，處理48 h后觀察各項(xiàng)指標(biāo)變化[7]。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 大鼠心肌H9C2細(xì)胞分為對照組(不做任何處理，control組)、阿霉素組(5 μmol/L阿霉素處理，DOX組)、過表達(dá)對照+阿霉素組(過表達(dá)對照病毒感染再用5 μmol/L阿霉素處理，DOX+NC組)和過表達(dá)NRF2+阿霉素組(過表達(dá)NRF2病毒感染再用5 μmol/L阿霉素處理，DOX+NRF2組)。

2.3Real-time PCR檢測H9C2細(xì)胞NRF2的mRNA表達(dá) 大鼠心肌H9C2細(xì)胞用TRIzol裂解液提取總RNA，操作按試劑說明書進(jìn)行，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，用TB Green? Premix Ex TaqTM進(jìn)行檢測。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法對NRF2 mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量分析[8]。

表1 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列

2.4Western blot檢測H9C2細(xì)胞NRF2、LAMP1 和 cathepsin B的蛋白表達(dá) 大鼠心肌H9C2細(xì)胞用PBS緩沖液清洗3次，再用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量后煮沸變性。配置10%的SDS-PAGE，每個(gè)泳道加入30 μg總蛋白電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入I抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜， II 抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光后成像系統(tǒng)采集，用ImageJ分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照，分析目的蛋白相對表達(dá)水平。

2.5NRF2穩(wěn)定過表達(dá)H9C2細(xì)胞構(gòu)建及過表達(dá)效果的檢測 大鼠心肌H9C2細(xì)胞按每皿106個(gè)細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后加入30 μL攜帶NRF2慢病毒或攜帶NC序列的慢病毒進(jìn)行感染，48 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，用含2 mg/L嘌呤霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每隔2～3 d進(jìn)行細(xì)胞傳代，培養(yǎng)2周后獲得NRF2穩(wěn)定過表達(dá)的H9C2細(xì)胞，采用real-time PCR和Western blot檢測NRF2的mRNA和蛋白表達(dá)情況，明確過表達(dá)效果，步驟同上。

2.6CCK-8法檢測H9C2細(xì)胞的活力 大鼠心肌H9C2細(xì)胞按每孔103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，依照不同分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，48 h后每孔中加入10 μL的CCK8試劑，37 ℃孵育1 h后測定波長450 nm的吸光度(A)值，以對照組為參照，計(jì)算其它各組H9C2細(xì)胞相對活力。

2.7H9C2細(xì)胞上清LDH、SOD、GSH-Px和CAT活性及MDA含量的檢測 大鼠心肌H9C2細(xì)胞按每孔103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，依照不同分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用比色法檢測LDH活性，羥胺法檢測SOD活性，比色法檢測GSH-Px活性，可見光法檢測CAT活性，TBA法檢測MDA含量，所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.8FITC-葡聚糖檢測H9C2細(xì)胞溶酶體pH值[9]大鼠心肌H9C2細(xì)胞按每皿106個(gè)細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，依照不同分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，48 h后各皿加入終濃度為0.2 g/L的FITC-葡聚糖，37 ℃培養(yǎng)1 h，利用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3遍，去除細(xì)胞外過量的葡聚糖。熒光顯微鏡下采集波長為490 nm激發(fā)光下的熒光圖片，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，分析熒光強(qiáng)度，并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算pH值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖形繪制和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。 以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DOX處理抑制心肌H9C2細(xì)胞NRF2的表達(dá)

Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)5 μmol/L DOX處理后，心肌H9C2細(xì)胞NRF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)，見圖1。這提示DOX能夠抑制心肌H9C2細(xì)胞中NRF2的表達(dá)。

2 過表達(dá)NRF2能有效促進(jìn)DOX處理的心肌H9C2細(xì)胞NRF2的表達(dá)

Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，心肌H9C2細(xì)胞感染NRF2過表達(dá)慢病毒后再經(jīng)5 μmol/L DOX處理，細(xì)胞中NRF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)，見圖2。這提示NRF2過表達(dá)能有效促進(jìn)DOX處理的心肌H9C2細(xì)胞NRF2的表達(dá)水平。

Figure 1. The change of NRF2 expression in H9C2 cells after DOX treatment. A: the results of real-time PCR for detecting NRF2 mRNA expression level; B: the results of Western blot for detecting the NRF2 protein expression level. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1 DOX處理后心肌H9C2細(xì)胞NRF2表達(dá)水平的變化

Figure 2. The effect of lentivirus infection on the expression of NRF2 in the H9C2 cells treated with DOX. A: the results of real-time PCR for detecting the effect of NRF2 lentivirus infection on NRF2 mRNA expression level; B: the results of Western blot for detecting the effect of NRF2 lentivirus infection on NRF2 protein expression level. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDOX group;#P<0.05vsDOX+NC group.

圖2 慢病毒感染對DOX處理后心肌H9C2細(xì)胞NRF2的過表達(dá)效果

3 過表達(dá)NRF2減輕DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷

CCK-8實(shí)驗(yàn)和LDH檢測結(jié)果顯示，DOX處理后心肌H9C2細(xì)胞的活力降低，LDH產(chǎn)生和釋放增多(P<0.05)；NRF2過表達(dá)提高細(xì)胞活力，減少LDH產(chǎn)生和釋放(P<0.05)，見表2，提示過表達(dá)NRF2能減輕DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷。

4 過表達(dá)NRF2減輕DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激

DOX處理后心肌H9C2細(xì)胞上清中SOD、GSH-Px和CAT活性降低，MDA含量增加(P<0.05)；NRF2過表達(dá)提高細(xì)胞上清中SOD、GSH-Px和CAT活性，減少M(fèi)DA含量(P<0.05)，見表3，提示過表達(dá)NRF2能減輕DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激。

表2 各組心肌H9C2細(xì)胞損傷指標(biāo)的比較

Table 2. The cell viability and the activity of LDH in the H9C2 cells of each group (Mean±SD.n=6)

GroupRelative cell viability LDH (U/L)Control1.00111.8±11.6 DOX0.55±0.10?273.8±14.7?DOX+NC0.53±0.09270.3±14.6DOX+NRF20.75±0.08#174.7±15.0#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX+NC group.

表3 各組心肌H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX+NC group.

5 過表達(dá)NRF2減輕DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞溶酶體功能障礙

DOX處理后心肌H9C2細(xì)胞溶酶體pH值升高，LAMP1和cathepsin B蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；NRF2過表達(dá)降低細(xì)胞溶酶體pH值，升高LAMP1和cathepsin B蛋白表達(dá)(P<0.05)，見圖3，提示過表達(dá)NRF2能減輕DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞溶酶體功能障礙。

討 論

腫瘤相關(guān)死亡是全球人口死亡的主要原因[10]，腫瘤篩查策略和各種新型抗腫瘤藥物的發(fā)展延長了腫瘤患者的生存期，但抗腫瘤藥物也有著嚴(yán)重的副作用，DOX作為一種衍生于鏈霉素的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，常用于白血病及多種實(shí)體瘤的化療[11]。然而，DOX對于心肌細(xì)胞的劑量依賴性毒性作用是化療期間備受關(guān)注的問題。氧化應(yīng)激是DOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的主要病理生理機(jī)制之一，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和抗氧化物質(zhì)的失衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激[12]。有研究報(bào)道DOX的累積劑量超過500 mg/m2，會(huì)引起氧化應(yīng)激的增強(qiáng)。 本實(shí)驗(yàn)表明，DOX處理后的H9C2細(xì)胞活力降低，LDH生成和釋放增多；細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，表現(xiàn)為SOD、GSH-Px和CAT的活性降低，以及MDA含量增加，說明DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。

Figure 3. The change of lysosomal pH and the protein expression of LAMP1 and cathepsin B in the H9C2 cells of each group. A: the result of lysosomal pH calculated by FITC-dextran; B: the results of Western blot for detecting the protein expression level of LAMP1 and cathepsin B. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX+NC group.

圖3 各組心肌H9C2細(xì)胞溶酶體pH值和溶酶體相關(guān)蛋白表達(dá)變化

NRF2是由NFE2L2基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，是一種堿性亮氨酸拉鏈蛋白，其能夠調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達(dá)以抵抗氧化損傷[13]。在基礎(chǔ)條件下，NRF2通過與細(xì)胞質(zhì)結(jié)合蛋白Keap1相結(jié)合形成復(fù)合物，減少NRF2入核及下游抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄，包括NADPH:醌氧化還原酶1、血紅素加氧酶1和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等[14]。本實(shí)驗(yàn)表明，DOX處理后的心肌H9C2細(xì)胞中的NRF2表達(dá)降低，NRF2過表達(dá)的H9C2細(xì)胞活力增加，LDH生成和釋放減少；細(xì)胞氧化應(yīng)激減少，表現(xiàn)為SOD、GSH-Px和CAT活性的增加，以及MDA含量減少，說明NRF2具有抗DOX誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激的作用。

溶酶體是一種膜包裹的囊狀細(xì)胞器，富含大量水解酶，在酸性條件下活性較高。一些刺激因素作用下，溶酶體膜完整性和功能遭到破壞，不能清除細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)，并釋放一些水解酶而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。LAMP1是位于溶酶體膜上的一類特異的蛋白質(zhì)，作為一種溶酶體標(biāo)志物，其蛋白表達(dá)水平能反映溶酶體功能情況[15]。而溶酶體功能也與其pH值密切相關(guān)，正常pH范圍為3.5～5.5，酸性環(huán)境被認(rèn)為有利于溶酶體水解酶發(fā)揮作用[16]，cathepsin B則是溶酶體水解酶其中的一種半胱氨酸蛋白酶類。這些指標(biāo)均常用于溶酶體功能的檢測，有研究報(bào)道酸性pH能誘導(dǎo)LAMP1蛋白結(jié)合能力[17]，此外酸性環(huán)境也能夠誘導(dǎo)cathepsin B在細(xì)胞內(nèi)的重新分布和分泌[18]。本研究結(jié)果顯示，DOX處理后溶酶體pH升高，降低LAMP1和cathepsin B蛋白的表達(dá)，說明DOX所致的H9C2細(xì)胞損傷模型中存在溶酶體功能障礙。有關(guān)NRF2調(diào)控溶酶體的報(bào)道很少，有研究表明，NRF2能通過LAMP2A調(diào)控溶酶體介導(dǎo)的自噬[18]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)NRF2能夠降低DOX所致的細(xì)胞溶酶體pH值升高，增加LAMP1和cathepsin B蛋白的表達(dá)，表明過表達(dá)NRF2能減輕DOX誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞溶酶體功能障礙。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的ROS能造成溶酶體膜穩(wěn)定性下降，使得溶酶體內(nèi)部水解酶釋放，造成細(xì)胞損傷[19]，其次ROS能與與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)通過溶酶體降解[20]。另有研究報(bào)道溶酶體穩(wěn)定性和功能破壞后釋放出的水解酶能夠作用于線粒體，破壞線粒體膜穩(wěn)定性，從而促進(jìn)氧化物的生成[21]。

綜上所述，阿霉素可導(dǎo)致NRF2表達(dá)減少，是DOX導(dǎo)致心肌損傷的機(jī)制之一，過表達(dá)NRF2可能通過減輕氧化應(yīng)激和溶酶體功能障礙發(fā)揮抗DOX損傷作用，這對于研究阿霉素心肌細(xì)胞損傷的病理生理機(jī)制具有重要意義。但本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，僅在H9C2細(xì)胞系中進(jìn)行研究，并沒有在整體動(dòng)物模型或原代心肌細(xì)胞中進(jìn)行探討，還需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。