李慧娟，楊 陽，常 平，鄭甲成，陳 亮，胡銀崗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是僅次于水稻的世界第二大糧食作物，種植面積最大、分布最廣。在我國，由于小麥主栽區(qū)氣候特征的影響，小麥灌漿期降水量嚴(yán)重不足，最終導(dǎo)致大幅減產(chǎn)，因此抗旱性成為小麥育種的重要指標(biāo)，而提高蒸騰效率是抗旱性改良的關(guān)鍵。

ERECTA(ER)是調(diào)控植物蒸騰效率的1個編碼類受體蛋白激酶的基因，通過與大分子物質(zhì)的相互作用來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，并且在植物抵御病菌侵染、干旱、高溫等生物和非生物脅迫中也發(fā)揮重要作用[1]。Xing等[2]在擬南芥中過表達(dá)楊樹的ER基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株生物量、光合速率和長期水分利用效率都有顯著提高。Villagarcia等[1]發(fā)現(xiàn)在番茄中過表達(dá)缺失激酶催化結(jié)構(gòu)域的擬南芥ER基因，對生長造成負(fù)面效應(yīng)的同時降低了對水分虧缺的抗性。針對禾本科作物的研究表明，過表達(dá)ER基因的轉(zhuǎn)基因玉米、高粱和水稻也表現(xiàn)出相似的特性[3-4]。此外，Shen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥ER基因?qū)χ参锏哪蜔嵝砸灿泻軓?qiáng)的效應(yīng)。盡管對擬南芥、水稻中ER基因的效應(yīng)有了比較深入詳細(xì)的研究，但是目前小麥TaER基因的功能研究尚處于起步階段，且其轉(zhuǎn)化相關(guān)研究還未見報道。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是近年來興起的一種針對整個轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定量分析的測序技術(shù)，通過對不同樣品所有mRNA的高通量測序，既能夠分析不同樣品在特定生長發(fā)育時期所有基因的表達(dá)量，也可以分析相同組織在不同條件下的基因表達(dá)差異[6-7]，已被廣泛應(yīng)用于植物應(yīng)對逆境響應(yīng)等研究。生物或非生物脅迫下，植物為了抵御逆境所造成的傷害，在基因的表達(dá)水平、分子代謝及生物代謝途徑方面都會發(fā)生極顯著的變化[8]。植物首先接收并識別由于環(huán)境變化而產(chǎn)生的信號，其次，在多種激酶及激素類物質(zhì)的作用下對信號進(jìn)行傳導(dǎo)，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄后加工及翻譯水平來對逆境進(jìn)行及時的響應(yīng)，從而減少逆境對植物生長發(fā)育所帶來的傷害[9]。因此，轉(zhuǎn)錄水平上的改變是植物對環(huán)境響應(yīng)的第一步，通過對逆境下基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和富集通路的深入分析有助于挖掘與逆境相關(guān)的重要基因及代謝途徑，從而進(jìn)一步揭示植物響應(yīng)脅迫的調(diào)控機(jī)制。

小麥TaER對抗旱性的效應(yīng)及作用機(jī)制尚不明確，本研究以本實驗室前期構(gòu)建的過表達(dá)TaER基因的小麥T3代轉(zhuǎn)基因株系及其野生型為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，比較分析轉(zhuǎn)基因株系與野生型在干旱脅迫下的基因表達(dá)差異，通過功能富集，深入分析過表達(dá)TaER株系在干旱脅迫下所引起的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并測定其光合、蒸騰參數(shù)，初步闡明TaER基因在干旱脅迫下的應(yīng)答機(jī)制，以期為小麥ER基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)小麥TaER基因應(yīng)用于小麥的抗旱性改良。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以T3代轉(zhuǎn)基因小麥株系[以小麥栽培品種Cadenza為受體，將位于小麥7BS上的TaER基因(NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號為JQ599261.2)的cDNA序列連接玉米組成型ubiqutin啟動子構(gòu)建表達(dá)載體，經(jīng)基因槍遺傳轉(zhuǎn)化獲得]通過目的基因檢測及表達(dá)水平分析獲得的高表達(dá)株系L1、L2及其野生型栽培品種Cadenza為材料。

試驗于2016-2017年間在西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)農(nóng)業(yè)節(jié)水研究院抗旱棚內(nèi)(34°7′ N，108°4′ E)進(jìn)行。根據(jù)完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計充分灌溉(well-watered,WW)和干旱脅迫(water-stressed,WS)兩種水分處理，每個處理設(shè)4次重復(fù)。

播種前充分灌溉，越冬、返青、拔節(jié)期，WW和WS處理依賴自然降水，期間的降水量為 184.2 mm。拔節(jié)后，抗旱棚平時開啟，雨天關(guān)閉，WS處理停止灌溉，WW處理分別在抽穗和灌漿初期各灌水20 mm。在灌漿中期分別取正常灌水與干旱脅迫下各株系的12個單株的旗葉樣品，其中4個單株旗葉樣品直接液氮速凍，-80 ℃超低溫冰箱保存用于DNA提取，其余8個單株的旗葉等量混樣速凍后用于轉(zhuǎn)錄組測序總RNA的提取。

1.2 TaER轉(zhuǎn)基因T3代陽性株系的鑒定

CTAB法提取各株系基因組DNA，在目的基因和載體區(qū)域分別設(shè)計正、反向引物對T3代轉(zhuǎn)基因株系的外源基因進(jìn)行檢測，目的片段大小為354 bp，4個生物學(xué)重復(fù)。引物序列見表1。由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為10 μL：5.0 μL的2×taqPCR Star Mix，正、反向引物(10 μM)各0.5 μL，0.5 μL的模板DNA(100 ng·μL-1)，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，最終確定T3代轉(zhuǎn)基因陽性株系。

1.3 TaER轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)量分析

利用qRT-PCR檢測目的基因TaER的表達(dá)水平，使用Trizol法提取三葉期T3代轉(zhuǎn)基因陽性單株第一葉的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)總體積為20 μL，具體各組分參照SuperReal PreMix Color (SYBR Green) Kit熒光定量試劑盒說明書配置。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性 15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，設(shè)置40個循環(huán)，引物序列見表1。以TaActin為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量，每個樣品3次重復(fù)。

表1 PCR及qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR and qRT-PCRW

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序及表達(dá)量計算

用Trizol法提取總RNA，使用e-spect蛋白核酸分析儀對RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測，檢測合格的樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行后續(xù)建庫及測序。將測序獲得的序列去除接頭序列及低質(zhì)量reads之后，將clean data比對到水稻參考基因組上，使用HTseq進(jìn)行表達(dá)量的計算。

1.5 差異表達(dá)基因的篩選及富集分析

用FPKM值統(tǒng)計基因的表達(dá)水平[10]，用基于平均值的高斯分布和基于統(tǒng)計量的經(jīng)驗分布通過DEGseq[11]軟件進(jìn)行差異基因的篩選，閾值為FDR≤0.01和│log2(fold change)│≥1，分別對充分灌水和干旱脅迫處理下的野生型與過表達(dá)株系的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行分析。

以q value <0.05為閾值，分別利用KOBAS3.0和GOseq[12]對差異基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。

1.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，以各處理葉片cDNA為樣品，選擇6個在不同水分處理下的差異表達(dá)的基因(表1)，用qRT-PCR分析其表達(dá)量，3個重復(fù)，具體反應(yīng)及程序參照1.3。

1.7 光合相關(guān)指標(biāo)的測定

用LI-6400便攜式光合儀(Li-Cor,Lincoln/NE,USA)測定灌漿期各株系的光合、蒸騰參數(shù)，同時參考Martin等的方法[13]測定并計算瞬時水分利用效率。用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與整理，SPSS16.0進(jìn)行方差分析與多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因檢測及表達(dá)量分析

對T3代轉(zhuǎn)基因株系基因組DNA進(jìn)行多次重復(fù)PCR檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因陽性植株可以擴(kuò)增出354 bp的特異片段，而非陽性植株和野生型則未擴(kuò)增出目的條帶；15個株系中，有9個株系為陽性株系(圖1)，陽性率為60%，表明部分T3代轉(zhuǎn)基因株系尚有分離。野生型標(biāo)記為WT，T3代轉(zhuǎn)基因株系標(biāo)記為L。

對獲得的陽性轉(zhuǎn)基因株系目的基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，所有陽性轉(zhuǎn)基因株系中外源TaER基因的表達(dá)量都不同程度的上調(diào)(圖2)，其中株系L1和L2上調(diào)幅度較高，因此以L1和L2株系為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，進(jìn)一步分析干旱脅迫下過表達(dá)TaER的轉(zhuǎn)基因株系與野生型在基因表達(dá)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的差異。

M:DNA Maker DL2000; 1～16分別為L1、WT、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14和L15。

M:DNA Maker DL2000; 1～16 represent L1,WT,L2,L3,L4,L5,L6,L7,L8,L9,L10,L11,L12,L13,L14 and L15,respectively.

圖1 轉(zhuǎn)基因植株TaER基因的PCR檢測結(jié)果

Fig.1 PCR analysis of transgenic plants forTaERgene

圖2 T3轉(zhuǎn)基因株系TaER基因的qRT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 QRT-PCR analysis of TaER gene for T3 transgenic lines

2.2 測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及比對情況評估

對2個水分處理下的野生型、L1和L2株系共6個混合樣品進(jìn)行測序，經(jīng)過原始數(shù)據(jù)過濾、質(zhì)控之后，野生型(WT_WW、WT_WS)、轉(zhuǎn)基因株系L1(L1_WW、L1_WS)和轉(zhuǎn)基因株系L2(L2_WW、L2_WS)分別獲得76 217 622、61 641 432、61 915 306、74 464 998、79 375 080和61 391 468條clean reads，樣品平均GC含量60.44%，Q20比例為94.21%，Q30比例為86.62%，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可進(jìn)行下游分析。

將clean reads比對到水稻參考基因組上，結(jié)果(表2)顯示，6個樣品在基因組上都有比較高的比對率，平均比對率為87.76%，最低為87.08%，最高為89.73%?？紤]到六倍體小麥遺傳背景的復(fù)雜性，超過87%的比對結(jié)果表明測序結(jié)果可靠，可以很好的滿足后期的分析需求。

2.3 差異表達(dá)基因分析

以FDR≤0.01和│log2(fold change)│≥1作為閾值，野生型為對照組，進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，結(jié)果如表3所示，同時通過韋恩圖分析四組差異表達(dá)基因(圖3)。結(jié)果表明，充分灌溉下，有1 439個基因在2個轉(zhuǎn)基因株系和野生型之間均差異表達(dá)，其中470個上調(diào)表達(dá)，969個下調(diào)表達(dá)；干旱脅迫下，有607個基因表現(xiàn)出共同的差異表達(dá)，其中352個上調(diào)表達(dá)，255個下調(diào)表達(dá)。

表2 測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Statistics of sequencing data mapped in reference genome

表3 過表達(dá)株系與野生型的差異表達(dá)基因數(shù)Table 3 Statistics of DEGs between over-expression lines and wild type

圖3 差異表達(dá)基因的韋恩圖Fig.3 Veen plots of DEGs

2.4 qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的可靠性，選擇6個在干旱處理下野生型與轉(zhuǎn)基因株系顯著差異表達(dá)的基因，用qRT-PCR進(jìn)行驗證。結(jié)果(圖4、圖5)表明，除了TRIAE_CS42_7DS_TGACv1_622753_AA2044770與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量數(shù)據(jù)有細(xì)微的差別外，其余基因都表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致的表達(dá)情況，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是客觀可靠的。

2.5 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

2.5.1 差異表達(dá)基因的GO富集分析

對正常灌水處理下的1 439個DEGs進(jìn)行GO功能分析，差異基因富集到分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過程3個類別的40個GO功能分類。其中，參與生物學(xué)過程的基因最多，其次為分子功能，較少的是細(xì)胞組分，分別占總數(shù)的58.65%、 28.05%和13.29%。富集差異基因數(shù)較多的20個GO功能(表4)中，細(xì)胞組分中類囊體和類囊體組的DEGs最多，均有28個，其次是光系統(tǒng)(24個)和光合膜(24個)；分子功能中DEGs富集最多的是催化活性(502個)、水解酶活性(211個)和氧化還原酶活性(140個)；生物學(xué)過程中代謝過程(548個)、光合作用(27個)的DEGs數(shù)量最多。

對干旱脅迫處理下的607個DEGs進(jìn)行注釋，經(jīng)分析，DEGs富集到GO數(shù)據(jù)庫的生物學(xué)過程和分子功能2個類別，共有30個功能分類。其中，參與到生物學(xué)過程的DEGs占9.70%，參與到分子功能的占71.66%。富集差異基因數(shù)較多的20個GO功能(表5)中，生物學(xué)過程的DEGs較多富集在脂質(zhì)代謝(34個)和膜脂代謝(12個)過程；分子功能中主要是與催化活性(260個)和水解酶活性(139個)相關(guān)的基因。

1～6:TRIAE_CS42_7DS_TGACv1_622753_AA2044770,TRIAE_CS42_7AS_TGACv1_569613_AA1820410,TRIAE_CS42_5BL_TGACv1_409850_AA1366530,TRIAE_CS42_4AL_TGACv1_288169_AA0939290,TRIAE_CS42_5BL_TGACv1_406947_AA1351690,and TRIAE_CS42_2BS_TGACv1_145841_AA0446640

圖4野生型和L1株系在干旱處理下差異基因的表達(dá)量FPKM值

Fig.4FPKM values of DEGs between wild lineand L1 line under drought stress

1～6:TRIAE_CS42_7DS_TGACv1_622753_AA2044770,TRIAE_CS42_7AS_TGACv1_569613_AA1820410,TRIAE_CS42_5BL_TGACv1_409850_AA1366530,TRIAE_CS42_4AL_TGACv1_288169_AA0939290,TRIAE_CS42_5BL_TGACv1_406947_AA1351690,and TRIAE_CS42_2BS_TGACv1_145841_AA0446640

圖5野生型和L1株系在干旱處理下差異基因的相對表達(dá)量

Fig.5Relative expression of DEGs between wildline and L1 line under drought stress

表4 正常灌水處理下野生型和過表達(dá)株系的差異表達(dá)基因GO注釋Table 4 GO annotation of DEGs under normal irrigation for wild type and over-expression lines

B、C、M分別為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能。表5同。

B:Biological process; C:Cellular component; M:Molecular function. The same in table 5.

2.5.2 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫，分析表明，正常灌水與干旱脅迫下，DEGs均顯著富集到8條途徑(表6)。干旱脅迫下，甘油磷脂、亞油酸、甘油脂和α-亞麻酸代謝途徑顯著富集，而光合作用-捕光蛋白及所涉及的3個氨基酸代謝途徑不再富集。

2.6 過表達(dá)株系和野生型的光合相關(guān)指標(biāo)

在小麥灌漿期，測定正常灌水與干旱脅迫處理下過表達(dá)株系和野生型旗葉的凈光合速率與蒸騰速率(表7)。結(jié)果表明，正常灌水處理下，TaER過表達(dá)株系L1和L2的凈光合速率均顯著高于野生型，平均提高18.58%；蒸騰速率平均提高了21.24%；瞬時水分利用效率平均提高了19.94%。干旱脅迫處理后3個株系的凈光合速率與蒸騰速率均降低，但是過表達(dá)株系L1和L2的凈光合速率仍顯著高于野生型；蒸騰速率平均較野生型降低了8.83%；而瞬時水分利用效率平均為野生型的1.9倍。

表5 干旱脅迫處理下野生型與過表達(dá)株系差異表達(dá)基因的GO注釋Table 5 GO annotation of DEGs under drought stress for wild type and over-expression lines

表6 野生型與過表達(dá)株系差異表達(dá)基因的KEGG富集分析Table 6 KEGG enrichment analysis of the DEGs between wild type and over-expression lines

-：無富集的差異表達(dá)基因。

-：Non-enriched differentially expressed genes.

表7 灌漿期光合和蒸騰性狀分析Table 7 Analysis of photosynthesis and transpiration traits at grain-filling stage

*和**分別表示轉(zhuǎn)基因株系和野生型在0.05和0.01水平上差異顯著。

* and ** indicate significant differences between transgenic lines and wild type at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

3 討 論

近年來，轉(zhuǎn)錄組水平的測序技術(shù)在很大程度上促進(jìn)了生物基因功能方面的研究。如今，RNA-seq也廣泛應(yīng)用于植物應(yīng)對逆境的響應(yīng)。本研究通過對正常灌溉和干旱脅迫的2個T3代轉(zhuǎn)基因株系及其野生型旗葉進(jìn)行RNA-seq測序，篩選出在2個轉(zhuǎn)基因株系與野生型之間正常灌水下的1 439個共同的差異表達(dá)基因，干旱脅迫下607個共同的差異表達(dá)基因。這表明某些基因參與小麥抗旱性的調(diào)控。而在正常灌溉條件下，L1和L2株系與野生型差異表達(dá)基因數(shù)目有較大的差異(L1為4 077個，而L2為2 769個)，這可能是由于在基因轉(zhuǎn)化過程中插入位點(diǎn)、拷貝數(shù)的不同以及在基因重組互換過程中產(chǎn)生的差異而影響了其他基因表達(dá)的變化。目前對于小麥轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究處于起步階段，基因功能注釋信息不夠完善，部分序列或基因無法獲得功能注釋信息，而水稻功能信息則比較完善，因此將水稻基因組作為參考進(jìn)行比對。

正常灌水下DEGs的GO功能主要富集到光合作用、催化活性、水解酶活性和氧化還原酶活性、類囊體、類囊體組分，干旱脅迫下的DEGs富集到的主要是脂質(zhì)、膜脂代謝基因、催化活性和水解酶活性。表明光合作用、脂質(zhì)和膜脂代謝基因在干旱脅迫下顯著富集，暗示這些基因可能在TaER過表達(dá)株系在適應(yīng)干旱方面發(fā)揮著重要 作用。

本研究KEGG分析表明，干旱脅迫下，DEGs富集到半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、甘油(磷)脂代謝、亞油酸代謝、光合作用-捕光蛋白和α-亞麻酸代謝，與前人在禾本科早熟禾屬的結(jié)果基本一致[14]。干旱脅迫后的差異基因主要參與了脂類代謝和光合作用，且甘油酯途徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶差異基因上調(diào)表達(dá)，擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75X被鹽脅迫、干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，通過糖基化脫落酸、油菜素內(nèi)酯、赤霉素、細(xì)胞分裂素和其他小分子物質(zhì)提高植物抗旱性[15]。表明這些基因可能通過植物激素調(diào)節(jié)對干旱的適應(yīng)。亞油酸和α-亞麻酸代謝中的脂氧合酶(LOX)基因下調(diào)表達(dá)。其參與生成脫落酸、茉莉酸等抗性信號分子響應(yīng)干旱脅迫，也可以催化亞麻酸氫過氧化而抑制光合電子的傳遞[16]。因此，這些基因可能通過植物激素、光合作用正調(diào)控干旱脅迫。光合作用-捕光蛋白途徑中Lhca1、Lhcb(1、3、4和6)差異表達(dá)基因在充分灌溉下均下調(diào)表達(dá)，而干旱脅迫后該途徑則無差異表達(dá)基因的富集，這些基因參與光吸收和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是光系統(tǒng)的組成部分[17]。在擬南芥光合作用調(diào)控中，ERECTA通過影響羧化酶最大羧化速率和電子傳遞能力來影響其光合能力[18]，推測這些基因可能通過調(diào)控光電子傳遞途徑，從而適應(yīng)水分逆境。

植株的凈光合速率可以作為評價其抗旱性強(qiáng)弱的生理指標(biāo)之一，抗旱性強(qiáng)的品種，能夠維持較高水平的光合特性[19]。分析田間光合、蒸騰參數(shù)，結(jié)果表明TaER過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因小麥株系的光合作用，這與擬南芥中ERECTA過表達(dá)提高凈光合速率的結(jié)果一致[18]，且在干旱脅迫下維持較高的凈光合速率與瞬時水分利用效率，降低蒸騰速率。因此，干旱脅迫下，TaER過表達(dá)株系可能通過調(diào)控光合作用和脂類代謝等途徑提高凈光合速率，為TaER調(diào)控蒸騰效率和響應(yīng)干旱脅迫提供了理論基礎(chǔ)。