蔣韞博，郭 燕，周雨馨，張改生,2，馬守才， 王軍衛(wèi)，牛 娜，趙惠燕2,，宋瑜龍,2

(1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術育種中心/國家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部工程研究中心/ 陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室， 陜西楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學植物保護學院，陜西楊凌 712100)

小麥是世界三大主要糧食作物之一，是人類賴以生存的重要食物來源。2015 年我國小麥實際播種面積在 2 400.0萬hm2以上，約占糧食作物總面積比重的 21.30%，是僅次于玉米、水稻的第三大糧食作物[1]。近年來，我國的小麥內(nèi)需超出了自身的產(chǎn)能，以致于不得不大量進口國外小麥以滿足國內(nèi)需求。2007-2016 年間，我國小麥消費總量以年均 0.2% 的增長率整體平穩(wěn)低速增長，于 2016 年達到 1.16 億 t，約占世界消費量的 1/5；小麥進口量則在 2013 年達到最高為 609 萬 t，約占世界當年小麥進口總量的 3.2%[2]。隨著國內(nèi)經(jīng)濟的高速發(fā)展，大量耕地用途被改變，導致農(nóng)田總面積減少[3]。為確保小麥生產(chǎn)滿足逐年穩(wěn)步增長的消費需求，減少對進口小麥的依賴，最安全途徑就是提高單產(chǎn)。

目前，美國是雜種小麥種植面積最大的國家，雜種小麥面積占小麥種植總面積的 1%；英國、阿根廷、印度、法國和澳大利亞等國也積極推動雜交小麥育種工作，年均累計推廣面積約 20 萬～30 萬 hm2[4]。小麥雜種優(yōu)勢利用被認為是今后小麥單產(chǎn)水平大幅度提高的有效途徑之一[5]，而小麥雜種優(yōu)勢利用的關鍵是獲得優(yōu)良的雄性不育系。現(xiàn)階段，小麥雄性不育系主要包括三大類：一是遺傳型不育系；二是光溫敏雄性不育系；三是化學雜交劑誘導的生理型雄性不育系[6]。基于上述三類雄性不育系，目前已形成了兩種不同的小麥雜種優(yōu)勢利用途徑，分別是“三系法途徑”和“二系法途徑”。因恢復系缺乏有效的育性恢復基因和雜交種干癟等因素嚴重限制了“三系法途徑”小麥雜種優(yōu)勢在生產(chǎn)中的應用[7-8]。另外，“二系法途徑”中光溫敏雄性不育系受環(huán)境因素影響較大，育性穩(wěn)定性較差[9-10]，在一定程度上限制了光溫敏二系雜交小麥的制種和大面積應用?；瘹⒍捣瓤朔爽F(xiàn)有遺傳型雄性不育系(核質(zhì)互作雄性不育系和光溫敏雄性不育系)對不育基因和環(huán)境條件的依賴，又擴大了雜種優(yōu)勢親本的選配范圍，加快了雜交種選育進程，還簡化了不育基因轉(zhuǎn)育的繁瑣程序[11-12]。因此，化殺二系法小麥雜種優(yōu)勢利用被認為是眾多雜種優(yōu)勢利用途徑中最具應用前景的類型之一。

小麥化學雜交劑 SQ-1 是我國具有自主知識產(chǎn)權、兼具高效、穩(wěn)定和廣譜等特征的小麥化學雜交劑，其誘導小麥產(chǎn)生雄性不育率可達到 95%～100%，飽和授粉結(jié)實率達 85% 以上，具有巨大的產(chǎn)業(yè)化應用潛力[13-15]。近年來，關于化學雜交劑 SQ-1 的研究多集中在不育機理研究[16-19]和殺雄嗪酸殘留[14,20]等方面，對其生態(tài)安全性評價一直未有深入研究，已逐漸成為限制 SQ-1 大面積應用的瓶頸，同時也是化控二系雜交小麥強優(yōu)勢雜交組合創(chuàng)制與大面積推廣的重要限制因素。因此，本研究以 5 kg·hm-2的 SQ-1 處理過的小麥和對照小麥(等量清水處理)作為食材分別飼喂麥長管蚜，通過分析蚜蟲生命表重要參數(shù)變化及其體內(nèi)SOD、POD、CAT 和AchE的活性變化，分別從昆蟲生態(tài)學、昆蟲生理學和昆蟲毒理學層面解析 SQ-1 的生態(tài)安全性，為 SQ-1 的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蟲源麥長管蚜來自西北農(nóng)林科技大學植物保護學院趙惠燕教授實驗室；供試小麥材料西農(nóng) 1376 和化學雜交劑 SQ-1 均由西北農(nóng)林科技大學張改生教授實驗室提供；酶活性測定所需試劑及試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 生命表研究

挑選顆粒飽滿、大小基本一致的西農(nóng) 1376種子種植于盛有相同基質(zhì)的穴盤中，置于恒溫 20 ℃、光照正常的溫室中培養(yǎng)。待小麥發(fā)育至四葉期，將第 1 代麥長管蚜接于正常小麥植株上進行飼養(yǎng)，待產(chǎn)仔后將同齡第 2 代麥長管蚜分成兩組：一組接于苗期均勻噴施過 5 kg·hm-2化學雜交劑 SQ-1 的小麥植株(30株)上，作為處理組；另一組接于苗期均勻噴施過等量清水的小麥植株(30株)上，作為對照組。每株小麥上僅接一頭麥長管蚜，其中每 10 頭作為 1 個重復，共 3 個重復。自接種第二天開始，每日上午 8:00-10:00觀察、記錄麥長管蚜的蛻皮、生長及產(chǎn)仔情況，直至第 2 代蚜蟲全部死亡。與此同時，逐個收集第 2 代麥長管蚜成蟲，液氮冷凍后于 -80 ℃保存，供酶活性測定。分別做好處理組和對照組蚜蟲的續(xù)代工作，連續(xù)飼喂直至第 11 代，并以相同的方法記錄第 6 代和第 11 代麥長管蚜的生命表數(shù)據(jù)和收集成蟲。

1.3 總酶液制備

分別稱取第2、第6、第11 代處理組和對照組麥長管蚜成蟲 0.02 g，加入 0.18 mL 預冷的生理鹽水，于冰浴中機械勻漿；將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管，2 500 r·min-14 ℃離心 10 min，取上清液作為待測酶液。 3次重復。

1.4 保護酶及解毒酶活性測定

1.4.1 總蛋白濃度測定

總蛋白濃度測定參照總蛋白定量測定試劑盒說明書(A045-3)并有所改動。將表1體系渦旋混勻， 37 ℃孵育 30 min。雙蒸餾水調(diào)零酶標儀，在 562 nm 波長、0.5 cm 光徑下測定各管 OD 值(光密度)。重復3次。按下列公式計算總蛋白濃度( μg·mL-1)：

表1 總蛋白濃度測定操作表Table 1 Measurement of total protein concentration μL

總蛋白濃度=(樣本OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度×樣本稀釋倍數(shù)

1.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

SOD活性測定參照SOD測定試劑盒說明書(A001-3)并做少量修改。將表 2體系渦旋混勻，于 37 ℃孵育 20 min，用酶標儀在 450 nm 波長下測定各管 OD 值(光密度)。重復3次。按下列公式計算 SOD 活性(U·g-1)：

SOD抑制率=[(對照OD值-對照空白OD值)-(樣本OD值-樣本空白OD值)]/(對照OD值-對照空白OD值)×100%

SOD活性=SOD抑制率÷50%×樣本稀釋倍數(shù)÷樣本蛋白濃度

表2 SOD活性測定體系Table 2 Mixture for determining SOD activity μL

1.4.3 過氧化物酶(POD)活性測定

POD活性測定參照POD測定試劑盒說明書(A084-1)并有所改動。將表 3 中配制的各體系渦旋混勻，3 500 r·min-1離心 10 min，取上清液。雙蒸餾水調(diào)零酶標儀，在 420 nm 波長、1 cm 光徑下測定各管 OD 值(光密度)。重復3次。并用下列公式計算 POD 活性(U·mg-1)：

POD活性=(樣本OD值-空白OD值)/(12×比色光徑)×反應液總體積/樣本量÷反應時間÷樣本蛋白濃度×1 000

1.4.4 過氧化氫酶(CAT)活性測定

CAT活性測定參照CAT測定試劑盒說明書(A007-1)并稍作改動。將表 4 中配制的各體系渦旋混勻，用雙蒸餾水調(diào)零酶標儀，在 405 nm 波長、0.5cm 光徑下測定各管 OD 值。重復3次。并用下列公式計算 CAT 活性(U·mg-1)：

CAT活性=(對照OD值-樣本OD值)×235.65×(1/60×取樣量)÷樣本蛋白濃度

1.4.5 乙酰膽堿酯酶(AchE)活測定

AchE活性測定參照AchE測定試劑盒說明書(A024)并有所修改。將表 5 中配制的各體系渦旋混勻，靜置 15 min。雙蒸餾水調(diào)零酶標儀，在412 nm 波長、0.5 cm 光徑下測定各管OD值。并用下列公式計算 AchE 活性 (U·mg-1)：

表3 POD 活性測定體系Table 3 Mixture for determining POD activity mL

AchE活性=(樣本OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度×樣本蛋白濃度

表4 CAT 活性測定體系配制Table 4 Mixture for determining CAT activity mL

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

生命表數(shù)據(jù)錄入 TWOSEX—MSChart[21]軟件，用 Bootstrap 方法[22]計算麥長管蚜各種群參數(shù)和繁殖參數(shù)。隨后對獲得的生命表參數(shù)如：內(nèi)稟增長率rm、周限增長率λ、凈增值率R0、平均世代周期T、產(chǎn)仔前總時間 TPOP、產(chǎn)仔天數(shù)和壽命等數(shù)據(jù)運用 Paired bootstrap test(成對自助檢驗)[22]進行差異顯著性檢驗，同時對處理組和對照組不同世代蚜蟲體內(nèi)各保護酶及解毒酶活性進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用 Duncan 多重比較檢驗法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性比較。最后，利用雙變量相關分析對各個酶之間的相關性進行分析，相關系數(shù)選擇 Spearman。成對自助檢驗使用 TWOSEX—MSChart，方差分析和相關性分析均使用SPSS Statistics 20。

表5 AchE 活性測定體系Table 5 Mixture for determining AchE activity μL

2 結(jié)果與分析

2.1 SQ-1 對麥長管蚜生命表重要參數(shù)的影響

2.1.1 SQ-1 對麥長管蚜種群參數(shù)的影響

麥長管蚜取食化學雜交劑 SQ-1 處理過的小麥后，其同一世代種群參數(shù)與對照組相比較，均受到了不同程度的影響，具體表現(xiàn)為：處理組麥長管蚜的內(nèi)稟增長率rm和周限增長率λ在第 2 代和第 11 代高于對照組，而處理組凈增值率R0在第 2 代和第 11 代分別高于和低于對照組，但差異均不顯著；處理組內(nèi)稟增長率rm、周限增長率λ和凈增值率R0均在第 6 代低于對照組(P<0.05)；處理組平均世代周期T在第 2 代、第 6 代和第 11 代均與對照無顯著差異(表 6)。

處理組麥長管蚜內(nèi)稟增長率rm和周限增長率λ隨世代增加呈遞減趨勢，世代間差異均不顯著。對照組內(nèi)稟增長率rm和周限增長率λ均呈先增加后減少趨勢，內(nèi)稟增長率rm和周限增長率λ在第 2 代與第 11 代無顯著差異，而在第 6 代分別顯著高于第 2 代和第 11 代(P< 0.05)。處理組凈增值率R0隨世代推移呈遞減趨勢，且第 2 代高于第 6 代和第 11 代(P<0.05)，第 6 代與第 11 代間無顯著差異。對照組凈增值率R0隨世代增加呈先增加后減少的趨勢，第 2 代與第 6 代和第 11 代無顯著差異，但第 6 代凈增值率R0顯著高于第 11 代(P<0.05)。麥長管蚜平均世代周期T隨世代增加，處理組呈遞減趨勢，第 2 代顯著高于第 11 代(P<0.05)，而第 6 代與第 2 代和第 11 代無顯著差異；對照組呈先減少后增加的趨勢，第 2 代平均世代周期T顯著高于第 6 代 (P<0.05)，而第 11 代與第 2 代和第 6 代無顯著差異(表 6)。

說明麥長管蚜可以適應一定劑量的 SQ-1 脅迫，即一定劑量的化學雜交劑 SQ-1 具有一定的生態(tài)安全性，可適量應用于大面積雜交種的 生產(chǎn)。

表6 化學雜交劑 SQ-1 對麥長管蚜成蟲種群參數(shù)的影響Table 6 Effect of chemical hybridization agent SQ-1 on population parameters in Sitobion avenae adults

數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示同一世代下處理組與對照組間存在顯著差異(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理下不同世代間存在顯著差異(P<0.05)。下同。

Different lower-case letters following the data indicate significant difference between the treatment group and the control group within same generation at 0.05 level,while different capital letters following the data indicate significant difference among different generations within same treatment at 0.05 level.The same below.

2.1.2 SQ-1 對麥長管蚜繁殖參數(shù)的影響

用化學雜交劑 SQ-1 處理后的小麥飼喂的麥長管蚜，其產(chǎn)仔前總時間(TPOP)、產(chǎn)仔天數(shù)和壽命在第 2 代、第 6 代和第 11 代均與對照組無顯著差異(表 7)。隨世代推移，麥長管蚜各繁殖參數(shù)變化趨勢不同，處理組TPOP 隨世代增加呈先減少后增加趨勢，其中第 2 代TPOP與第 6 代和第 11 代無顯著差異，第 6 代TPOP 顯著低于第 11 代(P< 0.05)；對照組TPOP 呈先減少后增加趨勢，第 2 代 TPOP 與第 11 代無顯著差異，而第 6 代TPOP 顯著低于第 2 代和第 11 代(P<0.05)。處理組麥長管蚜產(chǎn)仔天數(shù)呈遞減趨勢，各世代間均存在顯著性差異(P<0.05)；對照組產(chǎn)仔天數(shù)隨世代增加先增加后減少，第2代與第 6 代無顯著差異，而第 2 代和第6代顯著高于第 11 代(P<0.05)。處理組麥長管蚜壽命隨世代推移呈遞減趨勢，但各世代間均無顯著差異；對照組麥長管蚜壽命呈遞減趨勢，第2代顯著高于第 11 代(P<0.05)，第6代與第2代和第 11 代無顯著差異(表 7)。說明一定劑量的化學雜交劑 SQ-1 對麥長管蚜的種群繁殖能力無顯著影響，進一步佐證了小麥化學雜交劑 SQ-1 具有一定的生態(tài)安全性。

表7 化學雜交劑 SQ-1 對麥長管蚜成蟲繁殖參數(shù)的影響Table 7 Effect of chemical hybridization agent SQ-1 on fecundity parameters in Sitobion avenae adults d

2.2 SQ-1 對麥長管蚜體內(nèi)保護酶及解毒酶活性的影響

2.2.1 保護酶和解毒酶活性分析

處理組的SOD活性在第 2 代、第 6 代和第 11 代均顯著高于對照組(P< 0.05)。處理組 SOD 活性隨蚜蟲世代的增加依次遞減，而對照組 SOD 活性隨蚜蟲世代的增加呈先增加后減少的趨勢，相同處理麥長管蚜各世代間 SOD 活性均無顯著差異(圖 1A)。

與對照組相比，處理組各世代麥長管蚜 POD 活性均顯著高于對照組(P<0.05)。處理組 POD 活性隨蚜蟲世代的增加先增加后減少，第 6 代顯著高于第 2 代(P<0.05)，第 11 代與第 2 代和第6代間均無顯著性差異。對照組 POD 活性表達趨勢與處理組相反，第 6 代顯著低于第 2 代和第 11 代(P< 0.05)(圖 1B)。

圖柱上不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。

Different lower-case letters above columns indicate significant difference at 0.05 level.

圖1 化學雜交劑 SQ-1 對麥長管蚜成蟲體內(nèi)保護酶及解毒酶活性的影響

Fig.1Effect of chemical hybridization agent SQ-1 on protective enzyme activitiesand detoxifying enzyme activity inSitobionavenaeadults

與對照組相比，處理組麥長管蚜 CAT 活性在第 2 代和第 11 代顯著升高(P<0.05)，第 6 代與對照組差異不顯著。處理組CAT 活性隨蚜蟲世代增加先減少后增加，第 6 代和第 11 代顯著低于第 2 代(P<0.05)，第 6 代與第 11 代間無顯著性差異。CAT 活性在對照組隨蚜蟲世代增加依次遞減，第11代與第6代間無顯著差異，但第 11 代較第2代顯著降低(P<0.05)(圖 1C)。

各世代處理組 AchE活性均顯著高于對照組(P<0.05)。處理組和對照組 AchE 活性變化趨勢相同，均先增加后減少(圖 1D)。上述結(jié)果表明，SQ-1 對蚜蟲有一定的脅迫效應，但隨著世代的增加其脅迫效應逐漸減小，具體表現(xiàn)為保護酶及解毒活隨世代增加而呈先顯著升高后降低的趨勢。進一步說明，化學雜交劑 SQ-1 在蚜蟲體內(nèi)不具有富集效應；麥長管蚜可以通過調(diào)節(jié)自身的生理代謝過程對 SQ-1 的脅迫損傷進行修復[23]。

表8 保護活性和解毒活性間相關性分析Table 8 Correlation analysis of protective enzyme activities and detoxifying enzyme activity

*:P<0.05,**:P<0.01.

2.2.2 被測酶活性的相關性分析

由表8可知，SOD 活性、POD 活性、CAT 活性和 AchE 活性間均存在正相關關系，具體表現(xiàn)為：SOD 活性與 POD 活性及 CAT 活性呈顯著正相關，與 AchE 活性呈極顯著正相關；POD 活性與 CAT 活性相關性不顯著，但與 AchE 活性呈顯著正相關；CAT 活性與 AchE 活性呈顯著正相關。上述結(jié)果表明，SOD、POD、CAT 和 AchE 之間，可能存在某種相互促進的機制，但 POD 和 CAT 相互促進作用較小。

3 討 論

小麥是異源六倍體自花授粉純系作物，其新品種同質(zhì)化是目前小麥產(chǎn)量實現(xiàn)突破的瓶頸。利用化學殺雄途徑實現(xiàn)小麥雜種優(yōu)勢利用是提高小麥單產(chǎn)和實現(xiàn)糧食安全的重要途徑之一。SQ-1 是我國自主研制的一種殺雄效果優(yōu)良的化學雜交劑，在小麥發(fā)育的特定時期，以 5 kg·hm-2的 SQ-1 可誘導甘肅河西走廊、山西省晉南麥區(qū)、青海高原、四川等地小麥產(chǎn)生 95% 以上的雄性不育率[24-27]，且雌蕊發(fā)育及其他農(nóng)藝性狀均不受影響，表明該化學雜交劑具有廣譜性、高效性及器官專屬性。

本研究利用生命表對化學雜交劑 SQ-1 的安全性進行了初步研究，結(jié)果表明，麥長管蚜在取食 SQ-1 處理后小麥的種群參數(shù)平均世代周期T在各世代間均無顯著變化，而內(nèi)稟增長率rm、周限增長率λ和凈增值率R0僅在第 6 代顯著低于對照組，繁殖參數(shù)產(chǎn)仔前總時間 TPOP、產(chǎn)仔天數(shù)和壽命在各世代間均與對照無顯著差異。說明一定劑量的 SQ-1 對麥長管蚜種群參數(shù)存在一定影響，但隨著世代的增加麥長管蚜可逐漸適應 SQ-1 的脅迫，與 Luo等[28]研究結(jié)果不一致。差異的主要原因可能是本研究是在活體小麥上接蟲，并統(tǒng)計生命表代數(shù)高達 11 代，而 Luo 等[28]研究統(tǒng)計生命表的蚜蟲代數(shù)較低，且其主要用培養(yǎng)基保鮮麥葉飼喂蚜蟲，存在一定的環(huán)境脅迫。此外，SQ-1 濃度過高或噴施均勻程度是否會對蚜蟲生命表參數(shù)產(chǎn)生影響、 SQ-1 對田間益蟲以及進化地位更高的家畜和人類是否會產(chǎn)生負面效應等仍需進一步探究。

綜上所述，化學雜交劑 SQ-1 對麥長管蚜正常的生命活動和種群繁殖能力無顯著影響，可能依賴體內(nèi)的保護酶系統(tǒng)和解毒代謝的協(xié)同工作。進一步說明，生物自身保護酶系統(tǒng)和解毒代謝途徑可以修復一定劑量的化學雜交劑 SQ-1 對生物造成的脅迫損傷，因此認為小麥化學雜交劑 SQ-1 具有一定的生態(tài)安全性。有關麥長管蚜體內(nèi)解毒代謝和保護酶系統(tǒng)的相互作用、SQ-1 對蚜蟲 AchE 活性影響的分子機理、不同劑量 SQ-1 和不同噴施方法對蚜蟲的影響、SQ-1 對其他小麥害蟲和有益生物的影響乃至對家畜和人類的影響等還有待進一步研究。