邢小萍，周榮華，張盼盼，袁虹霞，李洪連

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,河南鄭州 450002)

菲利普孢囊線蟲(Heteroderafilipjevi)系危害小麥的重要孢囊線蟲種類，目前在全世界10多個(gè)國(guó)家發(fā)生危害[1-4]，在我國(guó)，該線蟲在黃淮麥區(qū)發(fā)生危害嚴(yán)重[5-6]。

病原物與寄主植物互作的過(guò)程中，植物體內(nèi)的水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和乙烯(ethylene，ETH)介導(dǎo)的抗病基礎(chǔ)傳導(dǎo)通路(basal signaling pathways,BSPs)產(chǎn)生的信號(hào)分子可激活一些防御基因的表達(dá)，可能會(huì)啟動(dòng)SA、JA和ET信號(hào)通路，植物出現(xiàn)對(duì)生物脅迫的廣譜抗性[7-9]。前人報(bào)道，煙草[10]、馬鈴薯[11]、擬南芥[12-13]等受到病原物侵染后，SA、JA和ETH作為內(nèi)源信號(hào)分子能夠激活植物體內(nèi)的系統(tǒng)抗性或抗病相關(guān)蛋白的表達(dá)[14]。在植物受病原物侵染后，已克隆的參與防御系統(tǒng)激活的基因主要有鈍化病原物致病因子的酶類、參與細(xì)胞壁修飾功能的一些蛋白、抗菌活性物質(zhì)、病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PRP)等[15]。植物病原物侵染寄主后誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物往往通過(guò)改變細(xì)胞代謝激發(fā)和調(diào)控防衛(wèi)反應(yīng)基因，或激活信號(hào)傳導(dǎo)通路的基因[16]。Tak和Mhatre[17]從受到外界因素刺激后抗性增強(qiáng)的葡萄體內(nèi)克隆得到bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因VvbZIP23。在小麥體內(nèi)也克隆得到與應(yīng)激和防御有關(guān)的TabZIP基因[18-19]。研究證實(shí)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物受到外界刺激后被誘導(dǎo)表達(dá)，主要參與植物的抗逆反應(yīng)[20-21]和防御反應(yīng)[22-24]。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物受到外界生物或非生物刺激后被誘導(dǎo)表達(dá)，調(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)[25-26]。小麥?zhǔn)懿≡秩竞笳T導(dǎo)表達(dá)的與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的TaPIM1基因參與植物的防御反應(yīng)，該基因的表達(dá)可使植物抗性明顯增加[27]。

綜上所述，病原物誘導(dǎo)條件下，對(duì)植物防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)及功能研究是植物抗病分子生物學(xué)的重要研究方向之一。鑒于此，本研究利用real time-PCR技術(shù)，對(duì)前期研究中篩選的與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、防衛(wèi)反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的10個(gè)基因在抗、感小麥品種的幼苗接種菲利普孢囊線蟲(H.filipjevi)后不同時(shí)段的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，旨在揭示該類基因在小麥?zhǔn)艿紿.filipjevi侵染后的合胞體建立階段的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種：感病品種溫麥19，由河南省農(nóng)科院秋樂(lè)種業(yè)有限公司提供；抗病種質(zhì)資源抗線2號(hào)，由中國(guó)科學(xué)院成都生物所提供。

供試線蟲群體：H.filipjevi許昌群體[5]，采自河南省許昌縣河街鄉(xiāng)半坡鋪村小麥病田。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥根組織的準(zhǔn)備

供試小麥材料的種子經(jīng)表面消毒后，在20±2 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)催芽后播至裝滿滅菌沙土的營(yíng)養(yǎng)缽(直徑10 cm×高10 cm)中，在光/暗比14/10 h、晝/夜溫度23±2 ℃/15±2 ℃的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)1周，小心拔出幼苗，將根系的沙土輕緩地沖洗干凈后放置在鋪有滅菌濕濾紙的淺塑料盤(長(zhǎng)40 cm,寬20 cm,深5 cm)中，每株小麥幼苗的根系均勻滴加0.5 mL從病田采集的孢囊孵出的二齡幼蟲(J2s)配成2 000條·mL-1的懸浮液，對(duì)照組根系滴加0.5 mL的無(wú)菌水。之后在小麥根系上覆蓋兩層浸濕的無(wú)菌濾紙，淺塑料盤放置于育苗條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)。分別在接種后1、2、3、5、7和9 d采集幼苗根系組織，每個(gè)材料各時(shí)間點(diǎn)處理組和對(duì)照組分別采集4株，經(jīng)液氮快速冷凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取、檢測(cè)、純化及反轉(zhuǎn)錄

小麥根系總RNA 參照Trizol (invitrogen)提取液操作手冊(cè)提取。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析所提取RNA 樣品的28S和18S條帶，檢測(cè)其完整性。參照RQ1RNase-FreeDnase (Promega,USA)試劑盒說(shuō)明書去DNA。隨后，按照cDNA 合成試劑盒操作說(shuō)明書以隨機(jī)引物Oligo dT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成合cDNA，-80 ℃保存。

1.2.3 Real time PCR 分析

引物信息：利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)各基因的引物 (表 1)，小麥的肌動(dòng)蛋白基因(actin) 做為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

表1 基因的Real time PCR引物信息Table 1 Primer of genes for real time PCR

Real time PCR定量檢測(cè)體系及結(jié)果分析：使用SYBR Premix (SYBR Green) 試劑盒進(jìn)行real time PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為12 μL，包含SYBR Premix 6 μL，正反向引物 (10 μmol·L-1) 各0.48 μL，cDNA 模板1.2 μL， 50×ROX Reference Dye 0.26 μL，RNase-Free ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到每個(gè)基因的Ct值，采用2-△△Ct法分析檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量[28]。采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)誤分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量及PCR體系檢測(cè)

提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/280均在1.8～2.1之間，隨機(jī)挑取6個(gè)樣本用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，28 S和 18 S條帶清晰，表明所提RNA無(wú)明顯降解(圖1)。采用常規(guī)PCR對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得與目的條帶大小相符的特異性基因片段，表明引物的特異性較好(圖2)。real time PCR分析結(jié)果顯示，各檢測(cè)基因擴(kuò)增后融解曲線均為單峰。

圖1 所提取總RNA 的質(zhì)量檢測(cè)Fig.1 Quality detection of total RNA

1:DNA marker; 2:UniGene JV948284; 3:UniGeneAK335102; 4:UniGene AK330737; 5:UniGene CV767657; 6:UniGene JP233598; 7:UniGene JP852719; 8:UniGene JF951950; 9:UniGene CD877975; 10:UniGene DR737925; 11:UniGene EU665453; 12:Actin

圖2 常規(guī)PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.2 Products amplified by conventional PCR

2.2 細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)

接種菲利普孢囊線蟲后，與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的UniGene AK335102和UniGene DR737925在抗病材料抗線2號(hào)和感病品種溫麥19中不同時(shí)段的表達(dá)如圖3。UniGene AK335102在溫麥19中隨時(shí)間延續(xù)其表達(dá)量增加；而在抗線2號(hào)中，在接種后1 d時(shí)，其表達(dá)量為1.079，在接種后的2、3和9 d，其表達(dá)量低于接種后1 d，而在5 和7 d其表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他時(shí)段，以7 d 時(shí)表達(dá)量最高，接種后1、3、5和7 d，其表達(dá)量是溫麥19中的 2.997、1.041、3.175和5.668倍，說(shuō)明UniGene AK335102在抗線2號(hào)中表達(dá)量高于溫麥19。UniGene DR737925在接種后的1和3 d時(shí)，在溫麥19中的表達(dá)量低于其在2、5、7和9 d的表達(dá)量；在抗線2號(hào)中，接種后該基因的表達(dá)量均較低，只在9 d后，其表達(dá)量較高；UniGene DR737925在溫麥19中各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均比抗線2號(hào)中高，尤其是在接種后的2、5和7 d，表達(dá)量是抗線2號(hào)中的15.353、12.442和 20.079倍。

2.3 應(yīng)激與抗性相關(guān)基因的表達(dá)

在接種菲利普孢囊線蟲2 d時(shí)，UniGene JV948284在溫麥19中的表達(dá)量明顯高于其他時(shí)段；而在抗線2號(hào)中的表達(dá)量在接種后5和7 d時(shí)明顯高于其他時(shí)段。UniGene JV948284在溫麥19中相對(duì)表達(dá)量較高，在接種菲利普孢囊線蟲的1、2、3、5、7、9 d，在溫麥19中的相對(duì)表達(dá)量分別是抗線2號(hào)中的7.553、44.071、17.655、 5.291、7.552和1.887倍 (圖3)。

UniGene JP233598在接種后 2 d時(shí)，在溫麥19中的表達(dá)量較高，隨接種時(shí)間的延續(xù)，表達(dá)量逐漸減少；在抗線2號(hào)中，接種后5和7 d時(shí)表達(dá)量明顯高于其他各時(shí)段，在接種的后期，表達(dá)量高于接種初始階段。在接種后1～3 d，該基因在兩種材料中的表達(dá)量差異相對(duì)較小，接種后的3、5、7和9 d，在抗線2號(hào)中的表達(dá)量分別是溫麥19中的1.128、6.451、12.952和6.878倍。

在溫麥19中，UniGene JP852719在接種后1和5 d時(shí)的表達(dá)量較低，其他各時(shí)段的相對(duì)表達(dá)量居于0.108～0.160之間；在接種后7 d時(shí)，在抗線2號(hào)中的表達(dá)量高于其他各時(shí)段；在接種5和9 d時(shí)的表達(dá)量高于接種后的1、2和3 d。在接種后2、3 d時(shí)，UniGene JP852719在溫麥19中的表達(dá)量高于抗線2號(hào)，但在接種5和7 d時(shí)，在抗線2號(hào)中的表達(dá)量明顯高于溫麥19；在接種后9 d時(shí)，在兩種材料中的表達(dá)量基本持平。

UniGene CV767657在溫麥19中的表達(dá)量在接種后期低于早期；抗線2號(hào)中該基因在接種后的3和9 d時(shí)表達(dá)量明顯高于其他各時(shí)段。接種線蟲后的1、2和5 d，UniGene CV767657在溫麥19中的表達(dá)量明顯高于抗線2號(hào)，分別為 67.143、29.530和9.337倍，而接種后3和9 d時(shí)，在抗線2號(hào)中的表達(dá)量明顯高于溫麥19，分別為 3.969和51.762倍。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)

UniGene EU665453屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子，在接種菲利普孢囊線蟲后的前3 d，該基因在溫麥19中的表達(dá)量變化不明顯，在接種后3 d，其表達(dá)量略有降低，在接種后5 d時(shí)，其表達(dá)量增加近1倍，在7 d和9 d時(shí)，該基因的表達(dá)量相較于接種早期明顯增加。在抗線2號(hào)中，UniGene EU665453在接種后3 d時(shí)表達(dá)量較高，為接種后1 d時(shí)的15.962倍，在接種后5 d時(shí)，其表達(dá)量比3 d時(shí)低2.733倍，之后其表達(dá)量呈增加趨勢(shì)(圖3)。

UniGene JF951950和UniGene AK330737屬于MYB族轉(zhuǎn)錄因子。在溫麥19中，接種后 2 d時(shí)，UniGene JF951950表達(dá)量比其他各時(shí)間點(diǎn)略高；在抗線2號(hào)中，該基因僅在接種后5和 7 d表達(dá)量較高，在接種后1 d，該基因在溫麥19和抗線2號(hào)中的表達(dá)量差異不大，在接種后2、3和9 d時(shí)，溫麥19中的表達(dá)量是抗線2號(hào)中的 2.870、3.096和1.686倍。在接種后5和9 d時(shí)，UniGene AK330737在溫麥19中的表達(dá)量比其他各時(shí)間點(diǎn)高；在接種3、5、7和9 d時(shí)，其在抗線2號(hào)中的表達(dá)量明顯高于接種后的1和2 d；接種后3、5和7 d時(shí)，其在抗線2號(hào)中的表達(dá)量明顯高于溫麥19，分別為11.614、1.799和 10.498倍。

與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的UniGene CD877975在接種菲利普孢囊線蟲后，在溫麥19中的表達(dá)量隨接種時(shí)間的延續(xù)逐漸增加，在9 d時(shí)，其表達(dá)量為26.183；而在抗線2號(hào)中，該基因的表達(dá)量隨接種時(shí)間的延續(xù)逐漸降低，在1 d時(shí)，抗線2號(hào)中的表達(dá)量為48.924，為溫麥19中表達(dá)量的 55.532倍，而其表達(dá)量為1.645在接種后9 d 時(shí)，在溫麥19中的表達(dá)量比抗線2號(hào)中的高15.917倍 (圖3)。

3 討 論

3.1 與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因

果膠裂解酶和富含羥脯胺酸糖蛋白影響高等植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，果膠裂解酶，能降解植物細(xì)胞壁，軟化植物組織，現(xiàn)已在番木瓜等多種植物中分離得到[29]，富含羥脯氨酸糖蛋白廣泛存在于高等植物細(xì)胞壁中，當(dāng)植物受到病原物侵染等外界刺激時(shí)，細(xì)胞壁中該類蛋白含量增加，可能與細(xì)胞壁強(qiáng)固和植物受到外界刺激后早期的防御、抗性密切相關(guān)[30]。本課題組運(yùn)用基因芯片技術(shù)分析了對(duì)菲利普孢囊線蟲感病的小麥品種根系受到線蟲侵染后早期的基因表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)與果膠裂解酶相關(guān)的UniGene AK335102表達(dá)受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，在抗性材料抗線2號(hào)接種菲利普孢囊線蟲后的1、5和7 d，該基因的相對(duì)表達(dá)量明顯比感病品種溫麥19高，推測(cè)該基因可能在線蟲侵染后取食位點(diǎn)建立和合胞體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。UniGene DR737925影響細(xì)胞壁中富含羥脯氨酸糖蛋白的含量，本研究中，接種菲利普孢囊線蟲后的各時(shí)段，UniGene DR737925在感病品種溫麥19中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于抗性材料抗線2號(hào)，該基因可能在線蟲侵染的過(guò)程中，發(fā)揮固化細(xì)胞壁的 作用。

3.2 應(yīng)激與抗性相關(guān)基因

富脯氨酸蛋白是植物的一個(gè)細(xì)胞壁蛋白，在植物受到生物或非生物刺激后誘導(dǎo)表達(dá)[31]，該基因可能在植物細(xì)胞發(fā)育及抗逆過(guò)程中發(fā)揮作用。Gothandam等[32]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在花中特異表達(dá)的富脯氨酸蛋白OsPRP3 在過(guò)表達(dá)時(shí)，植株的耐冷性顯著增強(qiáng)，從而提高耐寒性。另外，當(dāng)植物受傷后，傷口所在組織內(nèi)富含脯氨酸蛋白[33-34]。本研究中，與線蟲侵染應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的UniGene JV948284在接種菲利普孢囊線蟲的不同時(shí)段，溫麥19 中的表達(dá)量明顯高于抗線2號(hào)，這可能與易感材料對(duì)線蟲侵染的積極響應(yīng)有關(guān)。外界因素誘導(dǎo)后，植物體內(nèi)一些與抗性相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)。Yu等[35]研究發(fā)現(xiàn)，抗性小麥品種在接種條銹病菌后，過(guò)敏性誘導(dǎo)基因Ta-hir1表達(dá)量明顯增高。轉(zhuǎn)錄因子往往在植物受到外界刺激后誘導(dǎo)表達(dá)，該類基因中有些基因已被證實(shí)與植物的各類抗性密切相關(guān)，如葡萄在受到逆境脅迫后，bZIP轉(zhuǎn)錄家族的基因VvbZIP23強(qiáng)烈表達(dá)，抗逆性明顯增強(qiáng)[17]；Zhang等[18]和張 毅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，小麥在受到條銹病菌侵染后誘導(dǎo)表達(dá)的TabZIP基因與抗病和抗逆(低溫、高鹽)有關(guān)；小麥中存在多個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子與小麥抗逆反應(yīng)[20-21]和防衛(wèi)反應(yīng)[22-24,36]有關(guān)。本研究中，UniGene EU665453在接種菲利普孢囊線蟲后的早期，在溫麥19 中的表達(dá)量變化不明顯，而在抗線 2 號(hào)中，在接種后 3 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量較高。在接種菲利普孢囊線蟲的后期，在抗、感小麥中的表達(dá)量均逐漸增加，但在溫麥19中變化更劇烈，推斷該基因可能與合胞體維持有關(guān)。孢囊線蟲侵染后8 d左右時(shí)合胞體形成，之后抗病小麥根系的合胞體逐漸衰亡，導(dǎo)致侵入的線蟲不能繼續(xù)發(fā)育[37]。在植物受到外界生物或非生物刺激后，植物體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)[25]，從擬南芥體內(nèi)克隆的AtMYB44基因與植物對(duì)蚜蟲的抗性有關(guān)[26]。本研究中，UniGene JF951950在溫麥19和抗線2號(hào)中的表達(dá)量變化趨勢(shì)基本相當(dāng)，推測(cè)該基因可能在線蟲侵染后植物早期的防衛(wèi)反應(yīng)和合胞體的建立階段發(fā)揮作用較?。欢鳸niGene AK330737在抗線2號(hào)和溫麥19 中的表達(dá)差異較大，在溫麥19中，該基因在接種5 d 時(shí)相對(duì)表達(dá)量比接種 1 d時(shí)增加6倍左右，在接種后7 d 時(shí)，其表達(dá)量急劇下降，而在9 d時(shí)強(qiáng)烈增加；在抗線2號(hào)中，該基因在接種后3 d時(shí)，其表達(dá)量比接種后1 d時(shí)增加近12倍，之后各時(shí)段，其表達(dá)量變化不大，推測(cè)該基因可能參與線蟲侵染后植物的防御反應(yīng)及在合胞體建立階段發(fā)揮作用。

圖3 菲利普孢囊線蟲侵染后在不同時(shí)段的表達(dá)特性Fig.3 A time-course expression patterns of genes after H.filipjevi inoculated

3.3 轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因往往在植物早期的防御反應(yīng)發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，小麥紋枯病菌、根腐病菌侵染小麥后誘導(dǎo)表達(dá)的TaPIM1基因在小麥中參與防御反應(yīng)，轉(zhuǎn)入該基因的煙草對(duì)青枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)[27]。本研究中的UniGene CD877975在溫麥19中隨接種后時(shí)間的延續(xù)其表達(dá)量呈逐漸增加趨勢(shì)，而在抗線2號(hào)中，則隨接種時(shí)間的延續(xù)，表達(dá)量呈逐漸降低趨勢(shì)，由此推斷該基因與小麥對(duì)菲利普孢囊線蟲的抗性密切相關(guān)。