曹 瑩 崔詩晗 崔天姝

（四平市中心醫(yī)院，吉林 四平 136000）

1 資料與方法

1.1 一般資料：①實驗菌株：2015年1月～2016年12月吉林某三甲醫(yī)院ICU患者呼吸系統(tǒng)感染標(biāo)本383份。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853菌株由北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室提供。②試劑：MH培養(yǎng)基：伊紅美蘭培養(yǎng)基、酵母提取物、胰蛋白胨、Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、乙酸鈉、DNA Marker （1200 bp，2000 bp）蛋白酶K溴化乙錠聚乙二醇。③儀器：Gne AmpR PCR System 7200（Thermos Fisher，USA）；DY-WZ電泳儀（北京君意儀器廠）；UV WHITE-2020D凝膠成像分析系統(tǒng)（Biorad，USA）；TZK-900Z型紫外可見分光光度計（Dojin，Jap）；VITEK32型全自動細(xì)菌分析系統(tǒng)（法國生物－梅里埃公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定：在無菌環(huán)境下挑取標(biāo)本，接種于普通培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落在37 ℃的環(huán)境下轉(zhuǎn)種Maco平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落特征，轉(zhuǎn)種于雙糖鐵培養(yǎng)基上。用VITEK32型全自動細(xì)菌分析鑒定系統(tǒng)分離鑒定雙糖鐵上純培養(yǎng)的細(xì)菌，用18%甘油肉湯保存肺炎克雷伯菌臨床分離株，置-80 ℃冰柜凍存，備用。

1.2.2 K-B法檢測肺炎克雷伯菌臨床分離株的耐藥性：藥敏判斷結(jié)果依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2012標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，為敏感率（S）、中介率（I）、耐藥率（R）[1]。

1.2.3 肺炎克雷伯菌臨床分離株MIC的測定：結(jié)果判讀按照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI，2012）標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 肺炎克雷伯菌臨床分離株ESBLs表型確證。①肺炎克雷伯菌臨床分離株ESBLs初篩試驗：頭孢曲松的抑菌環(huán)≤25 mm，頭孢他啶抑菌環(huán)≤22 mm，頭孢噻肟或者氨曲南的抑菌環(huán)≤27 mm的菌落為高度疑似ESBLs菌，需要進(jìn)一步確認(rèn)[2]。②肺炎克雷伯菌臨床分離株ESBLs確認(rèn)試驗：用無菌棉拭子沾取菌液均勻涂布于整個MH瓊脂平板表面，同時使用頭孢他啶（30 μg）和頭孢他啶/克拉維酸（30/10 μg）及頭孢噻肟（30 μg）和頭孢噻肟/克拉維酸（30/10 μg）兩對藥敏紙片，當(dāng)兩個藥物中有任何一個在加克拉維酸后，抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸的抑菌環(huán)相比增大值≥5mm，可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.2.5 肺炎克雷伯菌臨床分離株ERIC-PCR的同源性分析。①肺炎克雷伯菌臨床分離株DNA提取。②ERIC-PCR反應(yīng)：ERIC-PCR引物序列見表1。

表1 ERIC-PCR引物序列

用1.5%的瓊脂糖凝膠用DNA Marker作參照，以82 V電壓進(jìn)行電泳40 min。在紫外線反射儀的觀察下，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和記錄結(jié)果。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法：菌株耐藥率之間的差異使用卡方檢驗。所有耐藥標(biāo)本數(shù)據(jù)采用PSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎克雷伯菌臨床分離株的鑒定與特征：2015年1月至2016年12，從吉林某三甲醫(yī)院的ICU院內(nèi)感染患者的383份呼吸系統(tǒng)標(biāo)本中分離出103株肺炎克雷伯菌，生化反應(yīng)菌均符合肺炎克雷伯菌[3]。初篩實驗中61株菌高度疑似產(chǎn)ESBLs菌。確認(rèn)實驗中有46株肺炎克雷伯菌單獨(dú)頭孢類抑菌環(huán)的直徑≥5 mm，同時加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑同時≥5 mm。

2.2 肺炎克雷伯菌臨床分離株耐藥性特征：在對抗菌藥物的耐藥性的比較中，其對頭孢菌素類的耐藥性有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001，P＜0.01），對氨基糖苷類藥品的耐藥性沒有明顯區(qū)別（P=0.550＞0.05），對碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性很高（100%），在產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌中其耐藥性要低于普通單純青霉素類。

2.3 肺炎克雷伯菌臨床分離株MIC值：46株產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌對氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑啉、氨曲南、頭孢克肟及頭孢他啶的MIC均＞256 μg/mL。阿米卡星、奈替米星、氨芐西林/舒巴坦及哌拉西林/他巴唑坦的MIC≥32 μg/mL。

2.4 肺炎克雷伯菌臨床分離株ERIC-PCR同源性分析：PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)8個條帶，范圍在100bp～2000bp的明顯的主條帶為6條，認(rèn)為僅相差1～2個條帶的視為基因型相似或密切相關(guān)；將相差2個條帶以上的視為不同基因型。相似度高于80%時認(rèn)為是該菌株在ICU院內(nèi)主要流行，且為該種菌株較為重要的基因型。46株產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌呈現(xiàn)為同一基因型（圖1），證明同一克隆株在該院出現(xiàn)了小規(guī)模爆發(fā)流行。

3 討 論

圖1 產(chǎn)ESBLs 肺炎克雷伯菌ERIC-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜

病原感染部位和耐藥程度也在不斷變化。及時掌握醫(yī)院感染微生物的特點，對于有針對性的制定醫(yī)院感染的管理和防治措施是非常重要的，尤其在ICU的住院患者的治療中。然而抗菌藥物的濫用導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生多重耐藥，感染“超級細(xì)菌”的風(fēng)險在逐漸增大[3-4]。臨床上由于大量高級頭孢菌素類抗菌藥物應(yīng)用于ICU院內(nèi)感染患者的治療過程中，尤其是三代頭孢的濫用及不合理使用，致使ICU患者病變部位的標(biāo)本中產(chǎn)生了大量的耐藥菌株，其中以產(chǎn)ESBLs的菌株為代表。目前針對高級頭孢菌素或者β-內(nèi)酰胺酶抑制劑治療無效的患者，只能進(jìn)一步采用碳青霉烯類抗菌藥物來達(dá)到治療G-桿菌的目的[5-6]。加強(qiáng)對醫(yī)護(hù)人員的抗菌藥物使用宣傳教育，對藥房，ICU住院環(huán)境進(jìn)行加強(qiáng)管理，做到切實切斷ESBLs細(xì)菌的傳染源和傳播途徑，引導(dǎo)醫(yī)護(hù)工作人員能夠進(jìn)一步進(jìn)行循證醫(yī)學(xué)，更加合理的應(yīng)用抗菌藥物[7-8]。

綜上所述，歸納為幾下3點：①某三甲醫(yī)院ICU感染細(xì)菌的臨床分布以呼吸系統(tǒng)最為常見。②非產(chǎn)ESBLs株的肺炎克雷伯菌對頭孢菌素的敏感性遠(yuǎn)高于產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌。產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物高度敏感。③產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌高度同源，為該院ICU內(nèi)主要的院內(nèi)耐藥菌流行株。