楊旭穎 安麗君

摘要：表皮毛是由高等植物地上部組織表皮細(xì)胞發(fā)育而來的一種特殊結(jié)構(gòu)，細(xì)胞周期調(diào)控因子在植物表皮毛細(xì)胞形態(tài)的建成過程中發(fā)揮著重要作用。利用原核表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建pET-28a-KRP2-FLAG融合表達(dá)載體，在大腸桿菌中對(duì)擬南芥細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子KRP2進(jìn)行了體外表達(dá)，并利用蛋白標(biāo)簽FLAG和His對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果表明，在大腸桿菌系統(tǒng)中成功對(duì)KRP2-FLAG進(jìn)行了體外表達(dá)并得到了純化的蛋白，蛋白量為0.87 mg。這為進(jìn)一步研究KRP2在表皮毛細(xì)胞發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：表皮毛;細(xì)胞周期調(diào)控因子;KRP2;原核表達(dá);FLAG標(biāo)簽;His標(biāo)簽;蛋白純化;擬南芥;基因克隆;重組蛋白

中圖分類號(hào)： Q78;S188+.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0063-03

植物表皮毛是植物地上組織表皮細(xì)胞形成的一種特化結(jié)構(gòu)，與表皮鋪板細(xì)胞持續(xù)進(jìn)行有絲分裂不同，表皮毛細(xì)胞在命運(yùn)決定之后將退出有絲分裂周期轉(zhuǎn)而進(jìn)入核內(nèi)復(fù)制。在模式植物擬南芥中，成熟的葉片表皮毛細(xì)胞需要經(jīng)歷4次核內(nèi)復(fù)制，從而使其核內(nèi)DNA含量達(dá)到32C，進(jìn)而形成特定的形態(tài)[1]。細(xì)胞周期調(diào)控因子在細(xì)胞由有絲分裂向核內(nèi)復(fù)制轉(zhuǎn)換的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其中細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK）是植物細(xì)胞周期的中心調(diào)控因子，細(xì)胞周期的一些進(jìn)程是通過調(diào)節(jié)CDKs活性進(jìn)行的[2]。與細(xì)胞周期素相對(duì)的是CDK抑制因子，它通過與CDKs直接結(jié)合負(fù)調(diào)控CDKs活性[3]。植物中第1種CDK抑制因子是由7種基因共同編碼的kip相關(guān)蛋白家族（KRP）：ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP3、KRP4、KRP5、KRP6、KRP7。ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP6過表達(dá)強(qiáng)烈抑制生長(zhǎng)并且影響器官形態(tài)建成。KRPs是一類帶有C末端區(qū)域（CTD）的小蛋白，它是結(jié)合CDK或細(xì)胞周期蛋白并執(zhí)行KRPs抑制功能所必需的一類因子[4]。而CDK活性在G1/M期和G2/M期轉(zhuǎn)換時(shí)會(huì)升高并且與蛋白磷酸化、起始DNA復(fù)制、有絲分裂相關(guān);轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、蛋白互作、轉(zhuǎn)錄后修飾或蛋白降解都能改變CDK活性，最終調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[5]。酵母雙雜體系中除了KRP5，其他KRPs都與CDKA;1（A類CDK激酶）互作而不與CDKB1;1互作，并且所有的KRPs可以與D型細(xì)胞周期素互作，表明KRPs抑制CYCD-CDKA復(fù)合物活性[6]。

CDKA;1和其特異性抑制因子KRP2調(diào)控?cái)M南芥葉片發(fā)育過程中有絲分裂向核內(nèi)復(fù)制的轉(zhuǎn)換。在有絲分裂活性組織中，調(diào)節(jié)KRP2過表達(dá)可降低CDKA;1活性，而在核內(nèi)復(fù)制的組織中它的活性不會(huì)降低，反而促進(jìn)核內(nèi)復(fù)制。CDKA;1的弱表達(dá)導(dǎo)致了CDK有絲分裂活性的特異性抑制，從而誘導(dǎo)核內(nèi)周期。CDKB1;1通過使KRP2磷酸化調(diào)控蛋白酶體降解;CDKB1;1的mRNA和蛋白水平在有絲分裂組織中要高于核內(nèi)復(fù)制組織，表明CDKB1;1促進(jìn)KRP2降解并且通過維持CDKA;1活性來抑制有絲分裂進(jìn)入核內(nèi)周期[7]。KRP2蛋白可以通過CDK磷酸化和蛋白酶體降解機(jī)制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后翻譯[8]，不同CDK蛋白之間的互作可以控制不同時(shí)期特異的CDK活性。

為進(jìn)一步研究KRP2在高等植物細(xì)胞周期中的生物學(xué)功能，本研究對(duì)擬南芥KRP2基因CDS序列進(jìn)行克隆，并在其3′端添加編碼FLAG標(biāo)簽的核苷酸序列，構(gòu)建了pET-28a-KRP2-FLAG融合表達(dá)載體;通過在大腸桿菌BL21（DE3）中體外表達(dá)，利用鎳柱親和層析純化，成功獲得了His-KRP2-FLAG重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、菌株和載體 擬南芥Columbia（Col-0）生態(tài)型野生型種子、大腸桿菌TOP10和BL21（DE3）、原核表達(dá)載體pET-28a，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子遺傳實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 試驗(yàn)中用到的限制性內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶Prime Star、T4連接酶、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）、反轉(zhuǎn)錄酶等購自Takara公司;His標(biāo)簽蛋白純化柱填料Ni Sepharose 6 Fast Flow、硝酸纖維素膜（0.45 μm），購自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部;6xHis抗體購自Abcam公司，F(xiàn)LAG抗體購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥KRP2基因片段克隆 提取野生型擬南芥總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;以此為模板用帶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;引物序列F：5′-CATGGATCCATGGCGGCGGTTAGGAGAAG-3′;R：5′-CATCTCGAGTCACTTATCATCATCATCTTTATAATCTGGATTCAATTTAACCC-3′（下劃線分別表示BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)），引物由北京六合華大基因有限生物公司合成。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切擴(kuò)增片段和pET-28a載體，連接酶切產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽性重組質(zhì)粒pET-28a-KRP2-FLAG進(jìn)行測(cè)序鑒定[9]。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株中，過夜培養(yǎng)后挑取陽性單克隆接種到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min小規(guī)模培養(yǎng)，待菌液D600 nm達(dá)到0.5～1.0時(shí)，加入終濃度為 0.2 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于 37 ℃ 誘導(dǎo)表達(dá)。分別收集誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后菌液，4 000 g離心10 min，收集菌體并用裂解緩沖液Lysis Buffer[50 mmol/L NaH2PO4（pH值8.0），300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑]重懸，冰浴，進(jìn)行超聲破碎（25 W，工作5 s，間歇5 s，15 min），結(jié)束后4 ℃、1 000 g離心30 min，分別收集上清和沉淀。以誘導(dǎo)前菌液為對(duì)照，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，之后利用BIO-RAD凝膠成像軟件分析誘導(dǎo)出的蛋白量，以不同梯度（0.125，0.250，0.500，1.000 mg/mL） 牛血清白蛋白BSA質(zhì)量濃度為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照[10-11]。

由于重組蛋白N端帶有His，C端帶有FLAG標(biāo)簽，所以本試驗(yàn)同時(shí)用Anti-His和Anti-FLAG進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。將2份蛋白樣品通過電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫條件下用含50 g/L脫脂奶粉的TBST[20 mmol/L Tris-HCl（pH值7.5），體積分?jǐn)?shù)0.1%的Tween 20，150 mmol/L NaCl]封閉 1 h，然后分別加入經(jīng)封閉液稀釋的Anti-His（1 ∶ 10 000，體積比）和Anti-FLAG（1 ∶ 1 000，體積比）4 ℃過夜孵育，次日將2塊膜用1×TBST洗3次，然后均加入鼠抗G&M（1 ∶ 10 000 體積比）室溫孵育 1 h，1×TBST洗3次，再用TBS洗膜 5 min，加入ECL工作液進(jìn)行顯色。

1.2.3 重組蛋白的純化 重組蛋白小規(guī)模原核表達(dá)成功后，按照原條件進(jìn)行目標(biāo)蛋白擴(kuò)大培養(yǎng)，收集400 mL IPTG誘導(dǎo)后的菌液，4 ℃、10 000 g離心10 min，菌體用Lysis Buffer重懸，因?yàn)楹罄m(xù)試驗(yàn)需要有活性的蛋白，故超聲破碎后離心收集上清，并將上清用0.22 μm濾膜超濾，然后和600 μL鎳柱混合，室溫孵育1 h，轉(zhuǎn)入簡(jiǎn)易重力柱裝置中，分別用0、50、100、200、400 mmol/L濃度的咪唑洗脫蛋白并檢測(cè)[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥KRP2目的基因片段克隆

由擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（www.arabidopsis.org）公布的基因序列可知，KRP2基因的CDS長(zhǎng)度為666 bp。以野生型擬南芥cDNA為模板，用帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增得到了與預(yù)期大小吻合的片段（圖1）;用BamHⅠ和XhoⅠ酶切目的片段與pET-28a載體（圖2），目的基因的條帶約為650 bp，載體骨架的大小約為5.3 ku。

2.2 原核表達(dá)載體pET-28a-KRP2的鑒定

目的基因片段與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后選取陽性克隆并提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電泳檢測(cè)表明目的基因片段成功克隆到了pET-28a表達(dá)載體中（圖3）。為了驗(yàn)證克隆到載體中的目的基因片段序列是否正確，將 pET-28a-KRP2重組質(zhì)粒進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果表明克隆到的序列與數(shù)據(jù)庫公布的序列完全一致，pET-28a-KRP2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，基因結(jié)構(gòu)如圖4所示。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的pET-28a-KRP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，建立重組蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)。37 ℃、0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后及超聲波處理后的上清和沉淀檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌液相比于誘導(dǎo)前在25～37 ku出現(xiàn)了新的蛋白條帶（圖5），與預(yù)測(cè)的KRP2蛋白分子量一致。為了進(jìn)一步確認(rèn)誘導(dǎo)表達(dá)出的蛋白條帶是目的KRP2-FLAG重組蛋白，分別以His和FLAG蛋白標(biāo)簽的抗體對(duì)誘導(dǎo)出的蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果表明誘導(dǎo)出的新蛋白條帶能被His標(biāo)簽抗體和FLAG標(biāo)簽抗體識(shí)別，證明本試驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功誘導(dǎo)出KRP2-FLAG蛋白，且重組蛋白主要存在于沉淀，上清中量較少，表明得到的重組蛋白主要以包涵體形式存在。通過Image Lab軟件灰度分析對(duì)目的蛋白濃度進(jìn)行定量，得到誘導(dǎo)后重組蛋白濃度約為0.181 mg/mL。

2.4 KRP2-FLAG重組蛋白的純化

試驗(yàn)后續(xù)是研究KRP2與CDKA;1、CDKB1;1三者之間的互作效應(yīng)， 需要具有活性的KRP2蛋白，而沉淀中的KRP2蛋白以不溶性包涵體形式存在，幾乎沒有活性，因而考慮通過擴(kuò)大培養(yǎng)菌體，利用鎳柱親和層析純化上清中的活性重組蛋白。將誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲波破碎后離心收集上清，與鎳柱室溫孵育后，用不同濃度咪唑洗脫并收集KRP2-FLAG蛋白，SDS-PAGE與免疫印跡檢測(cè)洗脫液。本試驗(yàn)成功獲得了純度較高的重組蛋白，且利用BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量，最終共得到0.87 mg重組蛋白（圖6）。

3 討論與結(jié)論

植物中細(xì)胞分化調(diào)控已經(jīng)取得了相當(dāng)不錯(cuò)的進(jìn)展，然而對(duì)高度可信的植物發(fā)育調(diào)控還沒有一個(gè)較好的解釋。目前研究證明了一些通過轉(zhuǎn)錄因子直接控制細(xì)胞周期的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的因子主要包括三大類：細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，這3類因子相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞周期[14]。KRP2作為CDK抑制因子之一，在G1/S轉(zhuǎn)換期，被泛素酶體降解掉，CDK被激活，進(jìn)入S期。有絲分裂周期向核內(nèi)周期的轉(zhuǎn)換機(jī)制對(duì)揭示細(xì)胞分化和器官大小控制進(jìn)程具有重要作用，為進(jìn)一步研究KRP2在高等植物中如何控制細(xì)胞進(jìn)程，本研究通過克隆擬南芥KRP2基因，以及原核表達(dá)并純化出具有活性的重組KRP2-FLAG蛋白，以期為后續(xù)研究有絲分裂向核內(nèi)周期轉(zhuǎn)換時(shí)CDKA;1、KRP2和CDKB1;1三者之間更為精確的互作效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

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