胡幸， 鄧星輝， 何凱寧

1江門市五邑中醫(yī)院病理科(廣東江門 529000)； 2江門市中心醫(yī)院病理科(廣東江門 529000)

肺癌是全球范圍內發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率和病死率均位于各種腫瘤的首位[1]。肺癌約85%是非小細胞性肺癌，其中肺腺癌是最常見的組織學類型。盡管近年來關于肺腺癌的手術治療、藥物靶向治療及放療均取得了長足的進步，但肺腺癌患者的總體生存率仍處于較低的水平[2]。探索新的肺腺癌惡性行為相關分子靶點及其內在機制，可望為隨后的靶向治療提供理論支持。睪丸特異性蛋白酶50(testes-specific protease 50，TSP50)，是一種新發(fā)現(xiàn)的癌/睪丸抗原(cancer/testis antigen，CTA)，CTA是一類僅在正常睪丸生殖細胞中及多種腫瘤中異常表達的抗原，在腫瘤早期診斷及靶向治療方面有著巨大的潛力[3-4]。TSP50己發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中高表達，并參與這些腫瘤的惡性進展，與多種腫瘤的臨床病理特征及預后存在著密切關系[3， 5-6]。目前關于TSP50在肺腺癌的表達及臨床意義的研究較少，英文文獻僅有2篇分別報道了TSP50在非小細胞性肺癌惡性生物學行為中的作用及臨床意義[7-8]，而中文文獻尚未見TSP50表達與肺癌關系的研究。而且，以往的研究并未對TSP50表達與肺腺癌或肺鱗狀細胞癌的關系進行獨立的分析。鑒于肺腺癌與肺鱗狀細胞癌在細胞起源、基因組學改變、預后等方面的差異[9]，因此，單獨對TSP50在肺腺癌的表達，及其與各項臨床病理特征的關系進行分析有助于我們更深入地了解TSP50在肺腺癌中的生物學功能和臨床意義。本研究主要通過免疫組化學方法探討TSP50在肺腺癌的表達情況及其與臨床病理特征的關系，從而為尋找肺腺癌早期診斷以及靶向治療提供新的候選標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2005年1月至2018年1月就診于五邑中醫(yī)院并行肺癌根治性手術治療的肺腺癌病例72例，其中男42例，女30例，中位年齡59歲。所有患者均為初治病例，手術前未接受過化療或放療，術后均經(jīng)病理確診為肺腺癌，我們對所有肺腺癌切片進行了鏡下復查，根據(jù)2015最新WHO肺腺癌分類標準進行了亞型分類。

1.2 免疫組織化學染色及判讀 石蠟包埋的肺腺癌及癌旁組織切片4 μm，烤箱預烤片2 h，隨后應用Envision二步法完成免疫組織化學染色：切片置于二甲苯脫蠟2次；切片逐級乙醇脫水；加3%H2O2去除內源性過氧化物酶；檸檬酸鹽緩沖液高壓加熱修復抗原；加一抗(TSP50，1∶200，Proteintech公司)，濕盒內4℃孵育過夜；加生物素化二抗，37℃孵育30 min；DAB顯色及復染、透明、中性樹膠封片。

免疫組織化學結果采用半定量方法，即：按著色強度分為0(不著色)，1(淺著色)，2(中度著色)，3(強染色)；按陽性染色細胞比例分為0(<5%細胞著色)，1(5%～25%細胞著色)，2(26%～50%細胞著色)，3(5%～100%)。以染色強度評分與陽性細胞比例評分乘積作為最終分值。綜合評分≤4為低表達，>4為高表達。以上評分由兩位高年資病理醫(yī)師獨立閱片評分，如遇獨立評分不一致則經(jīng)共同復核確定最終評分。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，肺腺癌及配對癌旁組織之間的TSP50蛋白表達差異應用t檢驗，TSP50蛋白表達與臨床病理的相關性采用2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TSP50在肺腺癌及癌旁組織的表達情況 對72例肺腺癌及配對的癌旁組織進行TSP50抗體染色，結果顯示TSP50蛋白主要在細胞胞質表達，未見細胞膜或細胞核著色。在72例肺腺癌組織中，高表達53例(73.6%，53/72)，而配對癌旁組織，高表達僅11例(15.3%，11/72)。兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖1。

A：肺腺癌HE切片(×100)；B：TSP50在肺腺癌組織中高表達(×100)；C：TSP50在肺腺癌組織中高表達(×400)；D：癌旁肺組織HE切片(×100)；E：TSP50在癌旁肺組織中低表達(×100)；F：TSP50在癌旁肺組織中低表達(×400)

圖1 TSP50在肺腺癌組織及癌旁組織的表達情況

2.2 TSP50表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關系 根據(jù)TSP50在肺腺癌組織中的免疫組化染色強度將肺腺癌分為高表達組(n=53)與低表達組(n=19)，分析TSP50蛋白表達肺腺癌臨床特征的關系。結果發(fā)現(xiàn)，TSP50表達與淋巴結轉移、TNM分期顯著相關(P=0.009，P=0.022)，而與患者性別、年齡、是否吸煙、腫物大小及組織學類型無明顯相關性(P>0.05)，見表1。

3 討論

肺腺癌是常見的肺癌組織學類型，隨著針對上皮生長因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)等靶基因的分子靶向治療的進展[10-12]，肺腺癌的預后水平己得到了明顯的改善，但仍有相當大部分的肺腺癌缺乏特異的基因靶標，無特異的靶向藥物可用，預后較差[13]。因此，發(fā)現(xiàn)和探索更多肺腺癌的特異性基因靶點，對于進一步開展針對性的分子靶向治療有著非常重要的意義。TSP50作為一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原，己被證實在乳腺癌、胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，是一個潛在的分子靶點[3， 5， 14]。但TSP50在肺腺癌中研究尚少，目前中文文獻尚未有TSP50與肺腺癌關系的研究報道，英文文獻中也僅個別研究報道了TSP50在非小細胞性肺癌的表達及功能，具體到TSP50與肺腺癌的關系尚未見報道。本研究對TSP50在肺腺癌中表達水平，其與臨床病理特征的關系進行了初步的研究。

TSP50最早由Yuan等[15]從睪丸組織和乳腺癌組織中分離出的低甲基化片段， 其基因位于人染色體3p14～p12，含有4個外顯子，全長1 155 bp。Xu等[16]的研究顯示TSP50在脾臟、腎臟、肝臟、肺、心臟等正常組織均不表達或表達量非常低，但是高表達在人正常睪丸組織和乳腺癌中，提示TSP50是一種腫瘤相關抗原，可能是乳腺癌等腫瘤的一個特征標記物。隨后多項研究也證實TSP50在結直腸癌、胃癌、喉癌中均高表達[5，14， 17]，本研究與文獻一致，發(fā)現(xiàn)TSP50在肺腺癌的表達明顯高于癌旁非腫瘤組織(P<0.001)。這些結果表明TSP50在多種腫瘤高表達可能是一個普遍事件，進一步表明TSP50作為一種癌/腫瘤抗原的特異性及其應用潛力。

表1 TSP50表達與肺腺癌臨床病理特征的關系 例(%)

我們的研究還發(fā)現(xiàn)高表達TSP50與肺腺癌存在淋巴結轉移及更晚期的TNM分期密切相關，而與性別、年齡、吸咽、腫瘤大小與組織學類型無明顯相關性。在胃癌中，TSP50表達與年輕患者、較晚TNM分期、有淋巴結轉移的病例呈明顯正相關，且高表達TSP50組中位生存年齡明顯低于低表達TSP50組[5，18]。在結腸癌組織中，TSP50的表達也明顯升高，且多因素Cox回歸模型顯示TSP50是結腸癌患者的一個獨立的不良預后因子[14]。這些結果與本研究結果一致，也進一步提示TSP50作為候選標志物在腫瘤診斷、評估淋巴結轉移、預后判斷等方面可能有著重要的作用。在肺癌中，Qiao等[8]近期的報道也表明TSP50在非小細胞肺癌中高表達，并且TSP50與淋巴結轉移、腫瘤分期及腫瘤分化程度密切相關，TSP50高表達可能是非小細胞肺癌的一項獨立不良預后因素，這些結果與我們的研究一致。但是該研究沒有分別對TSP50在肺腺癌及肺鱗狀細胞癌的表達進行獨立的分析，肺腺癌與鱗狀細胞癌的組織起源及分子事件均不同，TSP50的表達及作用可能也存在差異。因此，我們的工作集中于研究TSP50在肺腺癌的表達及臨床意義，有助于進一步探索TSP50在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。本研究的局限性也主要體現(xiàn)在：(1)僅對TSP50在肺腺癌的表達及臨床意義進行了研究，我們希望在以后的工作中對肺鱗狀細胞癌中TSP50的表達及其與臨床病理特征的關系進行分析，并比較TSP50在兩者的表達和臨床意義是否存在差異；(2)肺腺癌的病例數(shù)量尚有限，且是單中心病例，在后續(xù)的工作中希望能擴大樣本量，并納入多中心病例，以期得到更為準確可靠的結果；(3)缺乏與TSP50表達相對應的患者預后信息，雖然我們通過在線生存分析網(wǎng)站Kaplan-Meier Plotter (www.kmplot.com)分析發(fā)現(xiàn)，在886例肺腺癌中，TSP50高表達的患者生存時間顯著短于TSP50低表達的患者，這與本研究的結果是相吻合的，但是，如果能在同一批病例中進行表達量與預后的相關分析，結果可信度會更高，我們后續(xù)的工作將會完善相關的預后資料。

多項研究在細胞及動物水平均證實TSP50可促進腫瘤的增殖、侵襲及轉移。在胃癌細胞中，抑制TSP50表達可明顯減弱癌細胞的增殖及侵襲轉移能力，而上調TSP50表達可增強這些作用[5]。在乳腺癌中，TSP50 能夠通過 NF-κB依賴的方式上調 MMP-9的表達，進而增強腫瘤的侵襲性和轉移能力。在喉癌細胞中，下調TSP50表達，可抑制增殖并誘導癌細胞的凋亡[19]。而在肺癌中，TSP50的作用也少有報道，Qiao等[7]在非小細胞肺癌細胞株95D中研究發(fā)現(xiàn)，抑制TSP50表達可通過阻滯細胞周期從而抑制癌細胞生長。盡管如此，TSP50在肺癌中作用和機制還需要在更多體外細胞株及體內實驗來證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TSP50在肺腺癌中高表達，并與淋巴結轉移及臨床分期密切相關。這些結果為進一步研究TSP50在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制奠定了基礎，并可能為肺癌靶向治療提供一個新的靶點。