粟海軍

(1. 貴州大學(xué) 林學(xué)院, 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州大學(xué) 生物多樣性與自然保護(hù)研究中心, 貴陽(yáng) 550025)

精確鑒別外來物種的地理分隔種群或姊妹種的分類學(xué)關(guān)系有利于推測(cè)判定其來源并為生物入侵防控管理服務(wù)[1]，物種親疏關(guān)系與分類學(xué)地位的鑒別，在實(shí)踐上主要利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)進(jìn)行判別，當(dāng)形態(tài)特征不易分清時(shí)再輔以分子分析。但是，一些入侵多地形成許多地理隔離種群的外來物種，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法常難以鑒別[2]。某種麗松鼠屬松鼠(Callosciurusspp.)近幾十年來侵入歐洲，在法國(guó)、比利時(shí)和意大利對(duì)本地種和生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重危害[3]。這3個(gè)國(guó)家的外來松鼠種群在外形及毛色上極其相似，難以區(qū)分。幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)(Geometric morphometrics，GMM)近年來已成為動(dòng)植物學(xué)家研究物種形態(tài)細(xì)微變化及其他生物學(xué)問題的有力工具[4]，基于GMM方法可有效檢視形態(tài)上的細(xì)小差異并進(jìn)行圖形化分析[5]。

嚙齒類下頜骨是一種在發(fā)育上具功能集成性的復(fù)合骨結(jié)構(gòu)，其組件的生長(zhǎng)與形態(tài)反應(yīng)源自不同的胚胎起源和控制因素，如遺傳基因和環(huán)境壓力[6]，由于下頜骨在取食功能中的重要作用，在形態(tài)變化上較之其他骨結(jié)構(gòu)更容易受到環(huán)境(食物)壓力影響[7]。因此，下頜骨最后的形態(tài)變化(大小與形狀)是發(fā)育過程中基因與環(huán)境影響交互作用的表現(xiàn)[8]。為此，本研究應(yīng)用GMM，針對(duì)三地種群個(gè)體下頜骨的形態(tài)變化進(jìn)行研究，以期通過對(duì)三者間細(xì)微的形態(tài)變化差異與變化趨勢(shì)分析，推斷三者間親疏關(guān)系。

圖1 下頜地標(biāo)點(diǎn)設(shè)置圖示(示左下頜外側(cè))

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與地標(biāo)點(diǎn)設(shè)置

1.2 Procrustes擬合與形變來源分析

利用tpsSmall軟件采用廣義普魯克斯特分析(Generalized procrustes analysis，GPA)進(jìn)行疊置(superimposition)擬合[10]，得到單純的形狀坐標(biāo)點(diǎn)數(shù)據(jù)(Procrustes coordinates)與質(zhì)心大小數(shù)據(jù)(Centroid size，CS)進(jìn)行后續(xù)分析[11]。應(yīng)用ANOVA(Procrustes ANOVA)方法將各個(gè)體形狀配置與統(tǒng)計(jì)形狀(consensus)的方差偏離按不同的主要影響因素進(jìn)行分解，包括：個(gè)體(individual)為主因的形變(Ind)、左右對(duì)稱體各面(Side)為主因的形變(DA)、個(gè)體與左右邊交互影響(Individual×side)為主因的形變(FA)[12]；同時(shí)由于每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行了兩次拍攝和數(shù)字化，大量的重復(fù)冗余產(chǎn)生的方差偏離也在其中，因此用于評(píng)估測(cè)量誤差(Measurement errors)[13]。此外，對(duì)于種群和性別因素影響的差異，以種群和性別作為影響因子，以形狀中各地標(biāo)點(diǎn)為因變量(DVs)，采用MANOVA進(jìn)行分析[14]，為滿足MANOVA分析前提，形狀變量的正態(tài)性通過Kolmogorov-Smirnov分析進(jìn)行檢驗(yàn)。

表1 地標(biāo)點(diǎn)定義

在本研究的幾何形態(tài)測(cè)量運(yùn)算中，16個(gè)地標(biāo)點(diǎn)在二維坐標(biāo)中總計(jì)32個(gè)自由度，在疊置過程中因縮放、兩坐標(biāo)軸投射及旋轉(zhuǎn)逼近導(dǎo)致4個(gè)自由度喪失，因此形狀變量總自由度為28。

1.3 異速生長(zhǎng)影響、形變和種群親疏關(guān)系判別

異速生長(zhǎng)(Allometry)的影響緣自發(fā)育過程，因此無法在疊置時(shí)消除掉，因而需要在組間個(gè)體比較時(shí)去除異速生長(zhǎng)造成的影響，即尺度校正(Size correction)[15]。利用shape與size數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸來判定異速生長(zhǎng)是否存在[16]。使用完全的多因素協(xié)方差分析(MANCOVA)，以三地種群作為分組因素，log(CS)作為協(xié)變量，來檢測(cè)種群間回歸斜率的差異性[17]。當(dāng)斜率相同時(shí)，利用合并組內(nèi)回歸來控制異速生長(zhǎng)的影響。利用主成分分析(Principal components analysis，PCA)在兩個(gè)水平上分析各被分析種群平均形狀與目標(biāo)配置形狀間的相對(duì)形變[18]。利用1000次迭代的留一法交叉驗(yàn)證判別函數(shù)分析(Leave-one-out cross-validated discriminant function analysis，DFA)來判別群間親疏關(guān)系[17]。在PCA分析中，依據(jù)通過扭曲外廓圖形(Warped outline drawings)產(chǎn)生的相應(yīng)軸上的極端值來圖形化形變效果[19]，而在DFA中，扭曲外廓圖形展示的是被比較種群平均形狀間的形變差異。

Procrustes擬合、Procrustes ANOVA, PCA, DFA和相關(guān)的圖形化均使用MorphoJ軟件(Verson.1.06c)[20]進(jìn)行；Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)、MANOVA 和MANCOVA均利用PASW(SPSS v18)軟件進(jìn)行。用于檢驗(yàn)共有斜率的MANCOVA則利用TpsRegr(version 1.40)[21]軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形變來源

如表2所示，Procrustes ANOVA表明，樣本個(gè)體間(Ind)形變以極高的統(tǒng)計(jì)顯著性(P=0)解釋了包含大小和形狀的總形變的絕大部分(分別為99.2%和83.8%)；個(gè)體與左右邊交互影響(Individual×side)解釋總形變的0.5%(大小)和9.5%(形狀)；左右面(Side)為主因的形變(DA)解釋貢獻(xiàn)最小，而測(cè)量誤差的總形變貢獻(xiàn)僅為0.2%(CS)和4.3%(shape)，樣本個(gè)體均方超過測(cè)量誤差1283倍(CS)和39倍(shape)，因此，圖像拍攝與數(shù)字化誤差較小可忽略不計(jì)。

表2 三地外來松鼠種群下頜質(zhì)心大小與形狀的形變模式

SS: 普氏平方和Procrustes sum of squares;MS: 普氏均方Procrustes mean square;F: Goodall′sF統(tǒng)計(jì)值Goodall′sFstatistic;P: Goodall′sFp-values

Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)表明，除對(duì)稱組件中16號(hào)地標(biāo)點(diǎn)外(D=0.131,df=109,P<0.05)，其余所有變量均符合正態(tài)分布。MANOVA則顯示在兩水平上(即Ind和FA)各種群間均存在顯著差異，而種群間和種群內(nèi)的樣本性別因素影響均無顯著性差異(表3)。

表3 種群和性別間對(duì)下頜骨對(duì)稱和非對(duì)稱組件差異檢驗(yàn)

2.2 異速生長(zhǎng)與形變

MANCOVA斜率檢驗(yàn)表明3種群間異速生長(zhǎng)模式是一致的(Wilks′ Lambda = 0.499,F(56,152)= 1.126;P= 0.283)。隨后組內(nèi)回歸表明，異速生長(zhǎng)效應(yīng)解釋了形變總方差的2.99%(P= 0.0015)，根據(jù)圖形化結(jié)果(圖2)，可推斷當(dāng)個(gè)體(大小)發(fā)育增大時(shí)，3個(gè)種群的個(gè)體都會(huì)呈現(xiàn)更長(zhǎng)的冠狀突和角突、更前移的咬股嵴前緣和水平枝背部位置輕微向內(nèi)收縮。

不管是在Ind還是在FA的形變上，異速生長(zhǎng)都表現(xiàn)出顯著性影響(Ind: 2.99% predicted,P= 0.0009; FA: 3.72% predicted,P<0.0001)。去除異速生長(zhǎng)影響進(jìn)行尺度校正后，對(duì)于個(gè)體水平形變，前4個(gè)主成分解釋了71.4%的總方差(PC1=39.2%,PC2=17.1%,PC3=8.2%,PC4=6.9%)；對(duì)于FA形變，前4個(gè)主成分解釋了51.3%的總方差(PC1=24.1%,PC2=11.1%,PC3=8.4%,PC4=7.7%)。以主成分1和2的圖形化結(jié)果描述(圖3)，可知在個(gè)體水平上，冠狀突和角突部分對(duì)總形變貢獻(xiàn)最大，其次是臼齒槽、咬肌嵴位置和頦孔；在FA上，形變貢獻(xiàn)并不大，且主要發(fā)生在角突部分。從PCA散點(diǎn)圖看，以個(gè)體水平(Ind)差異可以清晰地將樣本歸為法國(guó)、比利時(shí)和意大利3組，而以FA上的變化則不能(圖3)。

圖為形狀數(shù)據(jù)對(duì)質(zhì)心大小數(shù)據(jù)的總體回歸，下頜外廓示X軸兩端由開始形狀(淡色線)到目標(biāo)形狀(深色線)的異速生長(zhǎng)總形變模式(4倍夸大扭曲外廓)

A group-centered regression of shape (Procrustes coordinates) on Log(Centroid Size); a 4-fold exaggerated warped outline drawing shows the overall allometric pattern from starting shape (light line) to target shape (dark line) at the extremes of the X-axis

圖2包含異速生長(zhǎng)影響的尺度依賴性形變

Figure 2 Size-dependent shape variation

下頜外廓示PC軸兩端2倍夸大扭曲的相對(duì)形變，淺色線示開始形狀，深色線示目標(biāo)形狀

At the extremes of the PC-axes, the relative variations of the mandibles are shown as warped outline drawings with 2-fold amplification. Light lines indicate starting shapes and dark lines represent target shapes

圖3尺度校正后的下頜形變主成分分析

Figure 3 Size-corrected principal component analysis (PCA)

2.3 種群親疏關(guān)系判別

DFA結(jié)果(表4)表明3個(gè)種群間存在顯著差異，BEL與ITA種群之間較之其他對(duì)比種群(BEL-FRA; ITA-FRA)更接近(圖3和圖4)。從圖形化結(jié)果比較來看，法國(guó)種群樣本下頜有更粗壯的水平分枝(horizontal ramus)且上升枝(ascending ramus)部分的冠狀突和角突部分略有點(diǎn)向內(nèi)收；比利時(shí)種群樣本的下頜冠狀突和角突則稍纖瘦且往腹背方向更為舒展；而意大利種群樣本的下頜形變特征則介于兩者間而更偏向比利時(shí)。

下頜外廓示各比較種群間平均形狀相對(duì)差異，扭曲形變2倍夸大

The relative differences between the mean shapes of each population are displayed by warped outline drawings corresponding to the color of the legend, exaggerated 2-fold in scale factor for better visibility

圖4 不同外來種群間的判別函數(shù)分析

3 討論

3.1 外來種麗松鼠的形變來源

定向不對(duì)稱(DA)、波動(dòng)不對(duì)稱(FA)和反對(duì)稱是生物形態(tài)中的非對(duì)稱類型[13]，前兩者能夠被Procrustes ANOVA檢測(cè)出來。DA在GMM中指的是下頜骨兩面的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)差異性[13]，盡管DA具統(tǒng)計(jì)顯著性，但由于它對(duì)總形變貢獻(xiàn)非常小，因而常常被忽略[22]。本研究中同樣如此，DA僅解釋總形變的0.1%(CS)和2.4%(形狀)。FA是僅次于個(gè)體間差異(Ind)的對(duì)總形變貢獻(xiàn)最大的因素(貢獻(xiàn)總形變的9.5%)，這也與其他嚙齒類的研究相似，如黃頸鼠(Apodemusflavicolli)達(dá)10.1%[23]，狐松鼠(Sciurusniger)達(dá)7.9%[22]。另外，樣本年齡可能也會(huì)對(duì)總形變有一定影響，但本研究均采用的成體樣本，且個(gè)體發(fā)育的異速生長(zhǎng)的影響已考慮進(jìn)來，因此成體后的年齡差異影響應(yīng)微乎其微[12]。

3.2 異速生長(zhǎng)與形變

異速生長(zhǎng)效應(yīng)對(duì)總形變的貢獻(xiàn)雖小(2.99%)，卻具有統(tǒng)計(jì)極顯著性，因此不能夠在總形變分析中被忽略，因?yàn)楫愃偕L(zhǎng)效應(yīng)都會(huì)模糊掉形變差異的來源[23]，因此，進(jìn)行尺度校正是十分必要的。去除異速生長(zhǎng)效應(yīng)后，總體形變模式能夠通過PCA分析反映出來。Atchley等曾指出，下頜骨表形特征發(fā)育過程極大地受到外部環(huán)境影響[24]。本研究中，3處外來種群個(gè)體間形變主要發(fā)生在包含冠狀突和角突的上升枝，而FA層次的形變主要發(fā)生在角突部位，角突部位是翼內(nèi)肌(medial pterygoid)和部分咬肌(masseter)著生部位，這一區(qū)域具發(fā)育不穩(wěn)定性，對(duì)環(huán)境壓力是十分敏感的，因其參與構(gòu)成的肌肉咬合功能極大地受到環(huán)境因子(如食譜條件、取食壓力等)影響[25]。但是，從PCA結(jié)果來看，在個(gè)體間(Ind)層次，70%以上的總形變被前4個(gè)主成分解釋，PC1和PC2即能清晰地將種群樣本分離歸組(圖3)，而FA層次卻不能有效分組，由于FA形變主要來源于外部環(huán)境壓力[26]，因此，可推斷3個(gè)種群個(gè)體雖然受不同的環(huán)境壓力(不同的生境、食物條件、氣候等)影響產(chǎn)生了形狀變化，但變化尚不十分明顯。

3.3 種群親疏關(guān)系判別

由于至今這種麗松鼠(Callosciurussp.)從何時(shí)何地引入歐洲三國(guó)的仍未明確[3]，因此確定其分類地位和親疏關(guān)系具有重要意義。Mazzamuto等利用Barcoding及頭骨傳統(tǒng)形態(tài)測(cè)量比較了這3種種群樣本[27]，分子結(jié)果表明，法國(guó)種群與赤腹松鼠(Callosciuruserythraeus)高度相似，而意大利和比利時(shí)種群則具有不同于法國(guó)種群的相同的單倍型，但兩者頭骨形態(tài)測(cè)量特征卻又與已知的赤腹松鼠樣本相似，因此其研究結(jié)果仍未得到明確結(jié)論。本文進(jìn)一步拓展了Mazzamuto等的形態(tài)學(xué)判別研究。DFA結(jié)果(圖4)表明，盡管意大利與比利時(shí)種群在馬氏距離上存在重疊，但兩者仍具有顯著差異，而法國(guó)種群則與這兩個(gè)種群明顯不同，應(yīng)屬不同的分類學(xué)地位，這支撐了Mazzamuto等的分子結(jié)果[27]。因此，我們推斷意大利與比利時(shí)種群可能來源于同一外來物種或同一來源，但兩者已產(chǎn)生部分分化，至少在下頜形態(tài)上因地理隔離和生態(tài)適應(yīng)而產(chǎn)生了分化。

利用GMM方法能夠細(xì)致的分析和比較出外來種群各自形態(tài)上的差異，從而推斷其親疏關(guān)系，GMM的準(zhǔn)確性與精確性，Cardini等曾做過深入討論與展示[28]，GMM的優(yōu)勢(shì)也使其在近年中迅速成為生物形態(tài)研究的熱門方法。受限于缺乏已知分類地位的樣本比較，本研究尚無法確定這些外來種群的分類學(xué)地位，但通過GMM手段有效克服了分子方法研究表型變化的不足，為進(jìn)一步厘清入侵種群來源提供了有益參考。