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        “天然植物抗菌液”(PAMs)對肝癌HepG2細胞的抑制作用及初步分子作用機制

        2019-08-21 08:44:02袁雪邱槿怡王思怡豆榮昆向飛丹州楊飄茆燦泉
        生物學雜志 2019年4期
        關鍵詞:切片預處理染色

        袁雪, 邱槿怡, 王思怡, 豆榮昆, 向飛丹州, 楊飄, 茆燦泉

        (1. 西南交通大學 生命科學與工程學院, 成都 610031; 2. 云南民族醫(yī)藥研究所有限公司, 昆明 650228)

        肝癌是一類嚴重危害人類生命的重大疾病。FoxM1的過量表達與肝癌的侵襲、轉移、耐藥、預后不良密切相關,其被認為是癌癥的致命傷和可作為肝癌預后和治療的潛在生物標志物[1-3]。中藥和民族醫(yī)藥是中華民族優(yōu)秀文化的傳承瑰寶,可望在包括肝癌在內的多種重大疾病的預防和治療中發(fā)揮重要的作用。“天然植物抗菌液”(Natural plant antimicrobial solution,PAMs)是云南民族醫(yī)藥研究所股份有限公司從紅花、紫草、刺天茄、蕓香草等多種民間和傳統(tǒng)中草藥中提取制備的一種復方產(chǎn)品,2015年其升級產(chǎn)品“紫蕓解毒止痛酊”獲批云南省醫(yī)院制劑(Z20150009)。前期研究發(fā)現(xiàn),PAMs對白血病、銀屑病、炎癥等多種疾病具有廣泛的生物學活性與作用[4],但其對肝癌細胞的作用、尤其是體內活性和分子作用機制尚不清楚。本文通過體內外實驗研究,并結合FoxM1的表達調控和凋亡作用分析,初步揭示PAMs對HepG2細胞的作用效果和分子機制,旨在為PAMs的進一步開發(fā)利用提供前期工作基礎。

        1 材料和方法

        1.1 PAMs的制備

        PAMs由云南民族醫(yī)藥研究所有限公司生產(chǎn)和提供,產(chǎn)品酒精含量為50%。

        1.2 細胞培養(yǎng)

        HepG2細胞培養(yǎng)在含10% FBS(Hyclone)和2%抗生素(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素,Hyclone)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中,并置于37 ℃和5% CO2的濕潤細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        1.3 細胞活力測定

        3×103個/孔HepG2細胞鋪于96孔板(Corning)中,培養(yǎng)24 h后,不同濃度的PAMs進行處理。24 h或48 h后,加入10 μL CCK-8并孵育1.5 h。酶標儀(Bio-Tek)450 nm波長檢測樣品吸光度值。相對抑制率(%)=(實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

        1.4 Western blotting實驗

        收集HepG2細胞并提取總蛋白。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉移至硝酸纖維素膜(Solarbio),5%脫脂牛奶封閉,一抗[FoxM1兔單抗(1∶ 1000,Proteintech);p53小鼠單抗(1∶ 500,Santa Cruz);Bcl-2兔多抗(1∶ 500,Elabscience);GAPDH單抗(1∶ 10 000,Proteintech)]、二抗孵育,最后,增強型ECL(ThermoFisher)化學發(fā)光檢測。GAPDH為內參對照。

        1.5 qRT-PCR

        TRIzol試劑提取HepG2細胞的總RNA,用逆轉錄試劑盒(ThermoFisher)將RNA逆轉為cDNA。用SYBR Green Master Mix試劑盒(Roche)進行qRT-PCR測定。94 ℃變性3 min,之后40個擴增循環(huán)如下:94 ℃變性30 s,60 ℃ 退火20 s,72 ℃延伸10 s。GAPDH基因為內參。相關基因的引物設計見表1。

        表1 相關基因的qRT-PCR引物

        1.6 裸鼠移植瘤實驗

        24只雄性BALB/c裸鼠(4~6齡)購自成都達碩實驗動物科技有限公司。隨機挑選6只裸鼠作為預處理組并用PAMs每天于左腋涂搽2次。一周后, 24只裸鼠于左腋下接種2×106個HepG2細胞。造模后,除PAMs預處理組外,其余裸鼠隨機分為3組(酒精對照組、PAMs處理組和5-氟尿嘧啶(5-FU,金耀藥業(yè))陽性藥物對照組)。后續(xù)處理中,PAMs和酒精各一天涂搽2次,每次100 μL每只;5-FU每2 d 20 mg/kg的劑量進行瘤內注射。每2 d測定體重并于22 d后處死裸鼠,采血和分離瘤體用于后續(xù)研究。游標卡尺測量裸鼠的腫瘤體積,V=長度×寬2/ 2。

        1.7 組織學和免疫組織化學實驗

        腫瘤組織用4%多聚甲醛固定和石蠟包埋,病理切片用蘇木精-伊紅染色并光學顯微鏡觀察。免疫組織化學染色則將制備好的腫瘤切片進行脫蠟和水化處理,并依次一抗、二抗共孵育。腫瘤切片用DAB和蘇木精進行染色,中性樹膠封片,最后光學顯微鏡下觀察和拍攝。Image-Pro Plus 6圖像分析軟件(Meyer)分析蛋白表達。

        1.8 細胞凋亡實驗

        Caspase檢測試劑盒(凱基生物)測定PAMs對細胞凋亡的影響。用預冷的裂解液裂解細胞,離心并保留上清液,加入反應緩沖液,然后分別與不同的caspase底物孵育。最后用酶標儀在405 nm處檢測caspase3、caspase8和caspase9的活性。

        TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche)檢測裸鼠移植瘤的細胞凋亡。腫瘤切片脫蠟并用蛋白酶K處理,切片與TdT和dUTP共孵育,經(jīng)過氧化氫處理后,DAB和蘇木精染色,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察和拍攝。

        1.9 統(tǒng)計分析

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19軟件(IBM),所有圖像均由Origin 8軟件(OriginLab)生成。Studentt檢驗評價兩組間的統(tǒng)計學差異,P<0.05為顯著差異。圖中均值和標準差由3個獨立實驗計算得到,與對照組相比,顯著性差異P<0.05,P<0.01和P<0.001分別標記為*、**和***。

        2 結果

        2.1 PAMs抑制HepG2細胞的活力并誘導凋亡

        CCK-8法測定結果顯示,隨著PAMs濃度和作用時間的增加,PAMs對HepG2細胞的抑制作用逐漸增強,4%的PAMs處理24 h即可達到60%以上的抑制效率,見圖1-A。與對照組相比,PAMs處理HepG2細胞24 h、48 h后顯著提高凋亡相關的caspase3、caspase8和caspase9的酶活(圖1-B、C)。qRT-PCR和Western blotting的測定顯示,與預期一致,PAMs處理后,p53上調、Bcl-2下調(圖1-D、E、F)。以上結果揭示PAMs促進HepG2細胞的凋亡。

        2.2 PAMs下調HepG2細胞中FoxM1的表達

        qRT-PCR結果顯示,4% PAMs處理HepG2細胞24 h和48 h后,F(xiàn)oxM1基因的表達顯著降低(圖2-A)。并且,PAMs顯著降低FoxM1蛋白的表達(圖2-B、C)。為此,我們推測,PAMs對肝癌的抑制作用與FoxM1的基因和蛋白表達量下調相關。

        A: CCK-8測定細胞活力; B、C:4% PAMs作用24 h、48 h后caspase3、caspase8和caspase9酶活測定;D: qRT-PCR檢測4% PAMs處理HepG2細胞24 h、48 h后p53、Bcl-2基因的表達;E、F: Western blotting檢測4% PAMs處理HepG2細胞24 h、48 h后p53、Bcl-2蛋白的表達

        圖1PAMs抑制HepG2細胞的活力并促進凋亡

        Figure 1 PAMs inhibited the cell viability and promoted the apoptosis of HepG2 cells

        A:qRT-PCR檢測FoxM1的基因表達;B、C: Western blotting 檢測FoxM1的蛋白表達

        圖2PAMs抑制FoxM1的表達

        Figure 2 PAMs inhibit the expression of FoxM1

        2.3 PAMs抑制HepG2裸鼠移植瘤的生長

        如圖3-A所示,酒精組腫瘤體積明顯大于其他組,但PAMs預處理組、PAMs組和5-FU組之間的腫瘤體積差異無統(tǒng)計學意義。所有模型中,酒精組的腫瘤體積最大,而PAMs預處理組的腫瘤體積最小(圖3-B),腫瘤體積與腫瘤重量變化趨勢基本一致(圖3-C)。HE染色顯示,PAMs預處理組、PAMs組和5-FU組的腫瘤切片中出現(xiàn)大量的細胞壞死,破碎和細胞核溶解(圖3-D)。此外,如圖3-E所示,PAMs預處理組、PAM組和5-FU組的腫瘤切片中出現(xiàn)了大量的陽性凋亡細胞,表明PAMs能促進移植瘤細胞的凋亡。另外,caspase3和caspase9蛋白的免疫組織化學染色結果進一步證明了PAMs能夠促進移植瘤細胞凋亡(圖4-A、B、C)。此外,PAMs處理顯著下調移植瘤細胞中FOXM1的基因表達量(圖4-D)。綜合以上結果,PAMs可通過下調FoxM1的表達、促進細胞凋亡從而抑制裸鼠移植瘤HepG2細胞的生長。

        A: 瘤體照片; B:移植后每3 d計算裸鼠移植瘤的腫瘤體積;C: 瘤體重量測定;D:瘤體HE染色;E:TUNEL測定腫瘤凋亡

        圖3PAMs抑制HepG2細胞移植瘤的生長并誘導凋亡

        Figure 3 PAMs inhibited the tumor growth and induced apoptosis of HepG2 xenografts

        A: caspase3、caspase9免疫組化染色;B、C: caspase3和caspase9免疫組化結果分析,IOD為積分光密度;D: qRT-PCR檢測FoxM1基因表達

        圖4移植瘤體caspase3、caspase9和FoxM1表達檢測

        Figure 4 The expression of caspase3, caspase9 andFoxM1 in xenografts

        3 討論

        本研究中,細胞活性檢測結果表明,PAMs可顯著抑制HepG2細胞活力。鑒于細胞凋亡是腫瘤細胞死亡的重要途徑,為此,首先對PAMs是否可以促進HepG2細胞凋亡進行檢測。與預期一致,PAMs可增強凋亡效應基因caspase3、caspase8和caspase9的表達,同時上調p53、下降Bcl-2的表達。作為重要腫瘤抑制因子,p53通過抑制腫瘤細胞的增殖和誘導細胞凋亡而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用[5-6],而作為癌基因的Bcl-2,通過調控增殖和凋亡相關基因的表達來抑制細胞凋亡[7-8]。以上結果確認了PAMs對HepG2細胞的促凋亡作用。

        高表達的FoxM1通過參與細胞增殖等在內的多種生物過程導致腫瘤的發(fā)生[9-10]。此外,F(xiàn)oxM1一直被認為是包括各種中藥提取物在內的多個抗癌藥物的治療靶標。從木蘭屬植物中提取的和厚樸酚 (Honokiol) 作為FoxM1的拮抗劑抑制FoxM1的表達并同時抑制FoxM1對下游基因的轉錄作用[11]。另外二芳基庚烷 (Diarylheptanoids) 通過調控FoxM1信號通路下調FoxM1及其下游基因的表達抑制胰腺癌的生長[12]。因此,通過qRT-PCR和Western blotting檢測PAMs誘導HepG2細胞凋亡是否與FoxM1表達量改變相關。結果顯示PAMs處理HepG2細胞后同時降低了FoxM1基因和蛋白的表達。為此,我們初步推斷PAMs可能通過下調FoxM1的表達,從而抑制肝癌HepG2細胞的活力并誘導細胞凋亡。

        通過裸鼠移植瘤模型進一步探究體外涂搽PAMs的抗腫瘤作用與分子機制。裸鼠移植瘤表明PAMs處理能顯著地抑制裸鼠移植瘤的生長。與體外細胞實驗結果相一致,病理組織切片HE染色、TUNEL實驗和免疫組織化學的實驗結果證實了PAMs能誘導移植瘤中HepG2細胞的凋亡。同時,PAMs處理降低了裸鼠移植瘤模型中的FoxM1的表達,這也與文獻報道下調FoxM1的表達能顯著地抑制肝癌細胞移植瘤的生長相一致[13-15]。此外,我們近期的研究證明了下調FoxM1的表達能強烈地抑制肝癌HepG2細胞在體外和體內的生長[16]。以上結果綜合揭示PAMs可能通過下調FoxM1的表達來抑制移植瘤的生長并促進凋亡。

        需要特別指出的是,體外涂搽PAMs頻率和劑量的增加可望更有效地增強PAMs的功效。鑒于PAMs以上生物學活性和分子作用機制,以及體外涂搽給藥的相對安全的處理方式,我們認為PAMs可望成為肝癌等疾病安全、有效和方便的候選藥物。在組學等系統(tǒng)生物學層面的影響與分子機制以及作用功效的進一步提高方面,尚有待進一步深入研究。

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