高 雄， 劉秀霞， 孫曼曼， 楊艷坤， 白仲虎

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122; 2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122; 3. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無(wú)錫 214122)

谷氨酸棒桿菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性工業(yè)微生物，廣泛用于一些有機(jī)酸的合成[1]。因具有無(wú)內(nèi)毒素、抗逆性強(qiáng)、蛋白酶水平較低等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)谷氨酸棒桿菌也正逐漸被開(kāi)發(fā)用于生物燃料的生產(chǎn)以及外源重組蛋白的表達(dá)[2-3]。

乙醇是各種分子伴侶的強(qiáng)烈誘導(dǎo)劑，分子伴侶表達(dá)水平的提高能夠促進(jìn)重組蛋白的可溶性表達(dá)[4-5]。盡管也有一些添加乙醇后對(duì)大腸桿菌蛋白表達(dá)產(chǎn)生有益效果的報(bào)道，但這一策略往往會(huì)因?yàn)榇竽c桿菌的乙醇耐受性較差而無(wú)法實(shí)現(xiàn)[6-7]。相比之下，革蘭氏陽(yáng)性菌株的有機(jī)溶劑耐受性要高于革蘭氏陰性菌株，谷氨酸棒桿菌又擁有較強(qiáng)的乙醇脫氫酶活性，可以利用乙醇作為唯一碳源生長(zhǎng)[8]。為了研究添加乙醇的策略是否能夠?qū)劝彼岚魲U菌表達(dá)重組蛋白產(chǎn)生促進(jìn)作用，筆者就乙醇添加對(duì)于谷氨酸棒桿菌EGFP的表達(dá)以及菌體生長(zhǎng)等方面的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647(CorynebacteriumglutamicumCGMCC1.15647)、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pXMJ19由本實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒p19-0(pXMJ19-mut△Ptac，△lacI，T7 Isolator)、pXMJ19-EGFP(pXMJ19-mut，△lacI，EGFP)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏[9]。自誘導(dǎo)載體PICL-B-EGFP在本研究中構(gòu)建。所用引物見(jiàn)表1，引物的合成和測(cè)序工作均由蘇州金唯智公司完成。

表1 本試驗(yàn)所用的引物Table1 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)。除非另有說(shuō)明，谷氨酸棒桿菌使用LBB(LB+1%腦心浸出液)培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min。抗生素使用氯霉素，作用終濃度在大腸桿菌中為 34 mg/L，在谷氨酸棒桿菌中為10 mg/L。

1.1.3 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶(Thermo Fisher Scientific)；Q5高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)；EsTaqMasterMix(康為世紀(jì)生物科技)；T4 DNA連接酶(TaKaRa Bio)；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒(Axygen Scientific)；基因組提取試劑盒(天根生化科技)。

1.1.4 主要耗材和儀器

高速冷凍離心機(jī)和PCR儀(Thermo Fisher Scientific)；超聲波細(xì)胞破碎儀：VCX800(SONICS)；熒光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù))。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

利用引物PICL-B-EGFP-UF/R對(duì)谷氨酸棒桿菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到帶有HindⅢ/以及bsaⅠ接頭的異檸檬酸裂合酶編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域(從ATG上游500 bp到ATG下游59 bp，包含了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及完整的5′末端非翻譯區(qū))。利用引物PICL-B-EGFP-DF/R對(duì)含有EGFP的質(zhì)粒pXMJ19-EGFP[9]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有bsaⅠ以及BamHⅠ接頭的EGFP片段(其5′末端含有一個(gè)保守的核糖體結(jié)合位點(diǎn)AAAGGAGGA)。將得到的啟動(dòng)子片段和EGFP片段分別用上述接頭對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶處理。酶切、純化后將兩片段與HindⅢ和BamHⅠ處理過(guò)的p19-0載體一起進(jìn)行連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建得到乙醇誘導(dǎo)載體PICL-B-EGFP。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線的繪制

將過(guò)夜培養(yǎng)的谷氨酸棒桿菌接種于50 mL新鮮培養(yǎng)基中，使初始OD600值為0.3。用移液器精確分裝48 mL培養(yǎng)物至24多孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL。置于30 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)，每隔2 h從對(duì)應(yīng)的孔中吸取培養(yǎng)物用于OD600和熒光強(qiáng)度檢測(cè)。

1.2.3 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白強(qiáng)度的測(cè)定

將待測(cè)的谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)物用PBS緩沖液洗滌兩次，重懸并將OD600調(diào)至0.5左右，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為507 nm。

1.2.4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品的制備

收集所有用于蛋白膠檢測(cè)的樣品，棄去上清。用PBS緩沖液洗滌兩遍，稱取相同濕重的菌體(約0.03 g)。加入1 mL PBS緩沖液重懸，利用超聲波破碎樣品(間隔2 s，破碎1 s，25%功率，15 min)至不再渾濁，破碎過(guò)程置于冰水混合物上。破碎后12 000 r/min，4 ℃離心15 min。取適量上清加入5×蛋白膠上樣緩沖液混勻，置于沸水浴煮5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇濃度對(duì)tac啟動(dòng)子表達(dá)EGFP的影響

檢測(cè)了含有pXMJ19-EGFP載體、tac啟動(dòng)子組成型表達(dá)EGFP的谷氨酸棒桿菌在0%、1%、3%和5%乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的OD600以及熒光強(qiáng)度。如圖1所示，顯然較高濃度的乙醇(4%、5%)對(duì)于谷氨酸棒桿菌的生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)都是有阻礙的。低濃度的乙醇(1%、2%)不但能促進(jìn)生物量大幅提升，而且可以顯著提高外源蛋白的表達(dá)水平。有趣的是，谷氨酸棒桿菌在3%乙醇濃度下培養(yǎng)24 h后，熒光強(qiáng)度和菌體OD600與不加乙醇的對(duì)照相比都基本一致，似乎展現(xiàn)出了某種平衡性。

圖1 不同濃度乙醇對(duì)單位熒光強(qiáng)度和OD600的影響

由此可見(jiàn)，乙醇的添加對(duì)谷氨酸棒桿菌存在著正反兩個(gè)方面的效應(yīng)：高于某個(gè)“平衡濃度”時(shí)，菌體生長(zhǎng)量和外源蛋白表達(dá)水平下降。低于“平衡濃度”時(shí)，生物量提高、外源蛋白表達(dá)水平提高。需要說(shuō)明的是，這一“平衡濃度”的具體數(shù)值理所當(dāng)然會(huì)與菌株、含有的質(zhì)粒以及培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。同時(shí)，“平衡濃度”所指的不僅僅是單純的使菌體生長(zhǎng)與對(duì)照組最接近時(shí)的乙醇添加濃度，這一濃度某種程度上也反映了菌體在脅迫環(huán)境中的總體生長(zhǎng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)至16 h之后，“平衡濃度”及以上的實(shí)驗(yàn)組和不加乙醇的對(duì)照組菌體生長(zhǎng)基本都已停滯或極為緩慢，但初始添加了低濃度乙醇的樣本此時(shí)還沒(méi)有達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，仍有較高的生長(zhǎng)速率(圖2)。

2.2 乙醇在被利用的過(guò)程中促進(jìn)了綠色熒光蛋白的表達(dá)

鑒于低濃度乙醇的添加對(duì)谷氨酸棒桿菌EGFP表達(dá)展現(xiàn)出了有益效果，筆者對(duì)其做了進(jìn)一步的探討。谷氨酸棒桿菌具有較強(qiáng)的乙醇脫氫酶活性，乙醇會(huì)經(jīng)過(guò)乙醇脫氫酶和醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，然后通過(guò)乙酸激酶(acetate kinase, AK)和磷酸轉(zhuǎn)乙?；?Phosphotransacetylase, PTA)轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A繼而進(jìn)入乙醛酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)途徑被菌體利用。并且，谷氨酸棒桿菌存在著與大腸桿菌中葡萄糖效應(yīng)類似的機(jī)制，即菌體會(huì)優(yōu)先利用速效碳源[10]。上述表達(dá)EGFP的谷氨酸棒桿菌的生長(zhǎng)和單位熒光強(qiáng)度變化曲線如圖2所示，不難看出EGFP水平相比對(duì)照的提高發(fā)生在菌體的二次生長(zhǎng)過(guò)程中，這一階段乙醇作為最主要的遲效碳源被菌體利用。葡萄糖的存在能夠顯著抑制乙醇脫氫酶等乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)從而抑制乙醇的利用[8, 11]。如圖3所示，在培養(yǎng)基中額外添加1%的葡萄糖、培養(yǎng)24 h后，菌體量相比對(duì)照大幅增長(zhǎng)，但EGFP表達(dá)水平下降。而在已含有1%葡萄糖的培養(yǎng)基中再加入1%乙醇后，菌體量和EGFP相比單純添加葡萄糖的培養(yǎng)基卻有所降低。由此可見(jiàn)，乙醇是在被利用的過(guò)程中促進(jìn)了EGFP表達(dá)的提高，乙醇對(duì)菌體的一些脅迫刺激作用例如對(duì)分子伴侶的誘導(dǎo)并不是熒光強(qiáng)度提高的原因。

圖2 生長(zhǎng)曲線和單位熒光強(qiáng)度的變化

2.3 乙酸無(wú)法完全替代乙醇誘導(dǎo)EGFP的表達(dá)

乙醇的利用會(huì)促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，熒光蛋白表達(dá)水平的提升也許只是更多代次的菌體增殖所致。乙酸是乙醇代謝過(guò)程的中間產(chǎn)物，谷氨酸棒桿菌同樣可以充分利用乙酸作為唯一碳源生長(zhǎng)。在Arndt等的報(bào)道中，谷氨酸棒桿菌在含有1%乙醇的合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率要略低于含有同樣濃度乙酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基[8]。如圖4所示，添加1%乙酸培養(yǎng)上述EGFP表達(dá)菌株48 h后，單位熒光強(qiáng)度相比對(duì)照只提高了約20%。在不添加葡萄糖的MM合成培養(yǎng)基[8]中，以乙醇為唯一碳源培養(yǎng)時(shí)的單位熒光強(qiáng)度仍會(huì)比乙酸高出約70%。因此，無(wú)法完全用乙酸的利用去解釋乙醇對(duì)EGFP表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)。在Arndt等的表達(dá)譜數(shù)據(jù)中，有39個(gè)基因在以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中表達(dá)水平顯著高于葡萄糖或乙酸碳源培養(yǎng)基，這些基因的功能涉及了鋅、鎂、錳離子的吸收以及三羧酸循環(huán)途徑[8]。此外，一些脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶等)的表達(dá)水平也會(huì)在以乙醇為唯一碳源時(shí)大幅提高，因此乙醇利用所導(dǎo)致的熒光蛋白表達(dá)提高或許和胞內(nèi)還原力水平有關(guān)。

圖3 添加葡萄糖對(duì)單位熒光強(qiáng)度的影響

*:P≤0.05; **:P≤0.01

圖4乙酸和乙醇對(duì)EGFP表達(dá)影響的對(duì)比

Figure 4 Comparison of the influence on EGFP expression between acetate and ethanol. Statistically significant differences compared with control sample were indicated with asterisks

2.4 幾種常見(jiàn)培養(yǎng)基的效果比較

考慮到低濃度的乙醇一方面能在菌體的二次生長(zhǎng)階段作為碳源被利用刺激谷氨酸棒桿菌大量生長(zhǎng)，另一方面又對(duì)外源蛋白表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用。因此當(dāng)利用谷氨酸棒桿菌進(jìn)行外源蛋白表達(dá)時(shí)，乙醇或許更適合作為補(bǔ)料碳源。如前文所述，谷氨酸棒桿菌的蛋白表達(dá)與大腸桿菌一樣會(huì)受到速效碳源的抑制，因而培養(yǎng)基中添加葡萄糖對(duì)于外源蛋白表達(dá)不利。利用大腸桿菌表達(dá)蛋白時(shí)往往會(huì)以甘油為碳源補(bǔ)料，然而谷氨酸棒桿菌很多關(guān)于外源蛋白表達(dá)的研究仍舊會(huì)以葡萄糖作為主要的碳源和能源，所使用的半合成培養(yǎng)基也大多是在酵母粉或LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，例如添加腦心浸出液(brain heart infusion，BHI)等物質(zhì)[13]。因此就乙醇和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加對(duì)谷氨酸棒桿菌熒光蛋白表達(dá)和菌體生長(zhǎng)量的影響進(jìn)行了對(duì)比。如圖5所示，培養(yǎng)48 h后，無(wú)論是OD600還是單位的熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度，在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加乙醇都要比添加昂貴的腦心浸液要好。有趣的是，完全由4%腦心浸出液構(gòu)成的BHI培養(yǎng)基雖然也能顯著促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但腦心浸出液的添加似乎會(huì)對(duì)蛋白表達(dá)產(chǎn)生一定的抑制作用。

圖5 不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加對(duì)EGFP和OD600影響的對(duì)比

2.5 乙醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的構(gòu)建

如圖6所示，在對(duì)圖2中36 h的樣品進(jìn)行的SDS-PAGE檢測(cè)中，1%乙醇的添加會(huì)使得菌體胞內(nèi)蛋白多出一條蛋白條帶，該條帶相比其他被1%乙醇誘導(dǎo)的蛋白更為顯著，這意味著乙醇對(duì)該啟動(dòng)子的誘導(dǎo)幅度較大又或者該基因的翻譯效率較高。經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)該條帶是乙醛酸循環(huán)中的異檸檬酸裂合酶(Isocitrate lyase，ICL)。為了對(duì)乙醇作為遲效碳源及其誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)的效應(yīng)加以利用，實(shí)驗(yàn)用該基因啟動(dòng)子以雙順?lè)醋拥男问綐?gòu)建了EGFP的表達(dá)載體，并對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)熒光蛋白的能力進(jìn)行了測(cè)試。其中雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)的應(yīng)用有助于提高翻譯效率以及mRNA穩(wěn)定性(構(gòu)建原理見(jiàn)圖7)[14-15]。如圖8所示，在含有1%乙醇的LBB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后，相比不添加乙醇的對(duì)照該表達(dá)載體具有9.5倍的誘導(dǎo)效果，相比自身對(duì)數(shù)期(4 h)的表達(dá)水平有著21.1倍自誘導(dǎo)效果。添加1%乙醇的條件下該自誘導(dǎo)載體的表達(dá)水平達(dá)到了tac啟動(dòng)子約65%的強(qiáng)度，高出不添加1%乙醇時(shí)的tac啟動(dòng)子約30%。Kim等開(kāi)發(fā)并優(yōu)化的谷氨酸棒桿菌自誘導(dǎo)載體表達(dá)sfGFP時(shí)的自誘導(dǎo)倍數(shù)為3.5倍，但由于該報(bào)道并沒(méi)有與傳統(tǒng)的tac啟動(dòng)子進(jìn)行對(duì)比，培養(yǎng)條件和表達(dá)的蛋白種類也有差異，因而無(wú)法對(duì)兩種自誘導(dǎo)啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行直接對(duì)比[16]。

圖6 SDS-PAGE檢測(cè)乙醇利用引起的胞內(nèi)蛋白表達(dá)變化

圖7 PICL-B-EGFP雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖

TSP: transcription start point; SD: Shine-Dalgarno sequence

圖8 PICL-B-EGFP載體的EGFP表達(dá)強(qiáng)度和誘導(dǎo)效果