何澤元 包堃旸 李倫 黃昌仁 幸文利

(遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 遂寧 629000)

微小RNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度18～22 個(gè)核苷酸非編碼RNA〔1,2〕，通過(guò)與靶基因的3′UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)〔3，4〕。研究證實(shí)miRNAs在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔5〕。腦膜瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤之一〔6〕，對(duì)miRNA在腦膜瘤中的表達(dá)及作用機(jī)制研究尚少，對(duì)腦膜瘤中miRNA表達(dá)及作用機(jī)制的研究，有助于明確腦膜瘤發(fā)病機(jī)制，指導(dǎo)治療。研究表明，miRNA(miR)-8能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖〔7〕，而其在腦膜瘤中的研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)腦膜瘤患者組織中miR-8的表達(dá)情況，初步探討miR-8的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性收集2016年1月至2017年1月遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)的22 例腦膜瘤患者手術(shù)標(biāo)本，男16 例，女6 例；平均年齡(58.6±11.7)歲，良性腦膜瘤(Ⅰ級(jí)) 9例，非典型性腦膜瘤(Ⅱ級(jí))8例，惡性腦膜瘤(Ⅲ級(jí))5例，患者均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為腦膜瘤，患者或家屬均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 人腦膜瘤細(xì)胞系IOMM-Lee購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，miR-8 mimics、miR-control(大連寶生物工程有限公司)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Introvigen公司)，地高辛標(biāo)記的anti-miR-8探針(EXIQON公司)。目的基因引物序列：miR-8：正義鏈5′-TAGCAAGTCGTAAGCTA-3′,反義鏈5′-GTTAGTAGGTCAATCGGGATAC-3′;miR-control：正義鏈5′-GACCTATCGGATAAGTC-3′,反義鏈5′-GTCAAATCGATCCGAT-3′;RAC1：正義鏈5′-GTAGCACGTAAGTCAGTCA-3′,反義鏈5′-GTCATAGCTGGGACATCCTAAC-3′;β-actin：正義鏈5′-GCTAGCTAACGTGAG-3′,反義鏈5′-GACCACGCTGCGCATGGA-3′。

1.3 原位雜交 腦膜瘤及瘤旁組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后，采用地高辛標(biāo)記的miR-8探針進(jìn)行原位雜交，37℃雜交過(guò)夜，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，染色強(qiáng)度由同一位高年資病理科醫(yī)生判斷。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人腦膜瘤細(xì)胞系IOMM-Lee，10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃、5% CO2恒溫箱；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IOMM-Lee細(xì)胞消化后以2×105/孔濃度接種至6孔板，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明miR-8與轉(zhuǎn)染試劑加入6孔板，輕輕混勻，培養(yǎng)箱中孵育8 h(miR-8組)，熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-8的表達(dá)，評(píng)估轉(zhuǎn)染效果，另取miR-control、生理鹽水作為陰性對(duì)照(miR-control)組和空白對(duì)照(NC)組，每組重復(fù)3次，收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 miR-8對(duì)IOMM-Lee細(xì)胞增殖活性的影響 取轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞，胰酶消化后，按2×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入10 μl噻唑藍(lán)(MTT)溶液，孵育4 h后，加入150 μl MTT溶液，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的OD值，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率；另取3組單細(xì)胞懸液接種到6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，吉姆薩染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

1.6 miR-8的靶基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)，在TargetScan預(yù)測(cè)Ras相關(guān)的C3肉毒素底物(RAC)1可能是miR-8的靶基因，設(shè)計(jì)RAC1基因引物序列，并在兩端加上XbaⅠ和 NotⅠ內(nèi)切酶剪切位點(diǎn)，RAC1 3′UTR 的上游引物序列：5′-ACGTTGAGGTAGTAGTCCGACA-3′，下游引物序列：5′-TCTATACGAGCGCTGACAG-3′，獲得重組載體pMD18-T-RAC1，將載體質(zhì)粒分別與3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性；另取3組細(xì)胞，熒光定量PCR檢測(cè)miR-8轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)RAC1 mRNA的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-8在腦膜瘤組織中的表達(dá) miR-8在腦膜瘤組織(85.6±23.7)中的表達(dá)顯著低于瘤旁組織(121.8±34.7，P<0.001)，DAB染色后可見(jiàn)棕色顆粒沉積(圖1)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)腦膜瘤中miR-8表達(dá)分別為：105.2±26.2、74.4±19.8、63.9±11.5，Ⅲ級(jí)腦膜

瘤中miR-8表達(dá)最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.364，P=0.004 3)，表明miR-8可能與腦膜瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

圖1 miR-8在腦膜瘤組織中的表達(dá)(×200)

2.2 miR-8對(duì)IOMM-Lee細(xì)胞增殖活性的影響 miR-8組miR-8 mRNA表達(dá)顯著高于miR-control組和NC組(P<0.05)，表明miR-8已成功轉(zhuǎn)染至IOMM-Lee細(xì)胞內(nèi)。miR-8組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的細(xì)胞抑制率均顯著低于miR-control組、NC組(P<0.05)，表明miR-8能抑制IOMM-Lee腦膜瘤細(xì)胞增殖。miR-8組細(xì)胞克隆數(shù)目顯著少于miR-Control組和NC組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組miR-8 RNA表達(dá)水平、不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞克隆數(shù)目比較

與miR-8 組比較：1)P<0.05；表2同

2.3 miR-8的靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 腦膜瘤組織中RAC1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于瘤旁組織(0.74±0.16 vs 0.28±0.08，P<0.001)，KLF2 mRNA在腦膜瘤組織、瘤旁組織中的表達(dá)分別為(2.23±0.45、1.98±0.36)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.005)。miR-8組熒光素酶表達(dá)及RAC1 mRNA顯著低于miR-control組和NC組(P<0.05)，見(jiàn)表2，表明RAC1可能是miR-8的靶基因。

表2 各組熒光素酶及RAC1 mRNA 表達(dá)比較

3 討 論

腦膜瘤發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的13%～26%，是常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)將腦膜瘤分為良性腦膜瘤、非典型性腦膜瘤和惡性腦膜瘤，對(duì)應(yīng)分級(jí)為Ⅰ～Ⅲ級(jí)〔8，9〕，手術(shù)切除是腦膜瘤治療首選方法，但惡性腦膜瘤具有生長(zhǎng)快、侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)，手術(shù)切除、放化療及立體定向外科治療等效果欠佳〔10～12〕。因此，了解腦膜瘤發(fā)病機(jī)制將有助于精確治療、改善預(yù)后。

miRNAs通過(guò)與靶基因相互作用而抑制靶基因的表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控〔13〕。有學(xué)者〔14〕報(bào)道m(xù)iR-145能抑制IOMM-Lee腦膜瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力，表明MicroRNAs可能與腦膜瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-8是miRNA家族成員之一，研究證實(shí)miR-8可能與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲等密切相關(guān)〔7〕。本研究通過(guò)地高辛標(biāo)記的miR-8探針進(jìn)行原位雜交，結(jié)果顯示miR-8在腦膜瘤組織中的表達(dá)低于瘤旁組織，在Ⅲ級(jí)惡性腦膜瘤中表達(dá)最低。表明miR-8在腦膜瘤中呈低表達(dá)狀態(tài)，表達(dá)水平與WHO分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。而且，miR-8 mimics轉(zhuǎn)染IOMM-Lee細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性受到抑制、細(xì)胞克隆數(shù)目減少，從細(xì)胞水平亦證實(shí)miR-8過(guò)表達(dá)抑制腦膜瘤細(xì)胞增殖，因此，可以推測(cè)miR-8可能與腦膜瘤發(fā)生發(fā)展及惡性程度有關(guān)。

RAC1在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)〔15〕，定位于人染色體7p22，是Rho-GTPase家族的主要成員之一〔16〕，有研究發(fā)現(xiàn)RAC1能夠誘導(dǎo)聚集肌動(dòng)蛋白微絲，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移，是細(xì)胞癌基因之一〔17〕，miR-204、miR-142-3p、miR-124等miRNAs通過(guò)靶向調(diào)控RAC1促進(jìn)肝癌、胰腺癌、前列腺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲〔18，19〕。TargetScan是預(yù)測(cè)miRNAs靶基因的重要生物信息平臺(tái)，通過(guò)堿基配對(duì)匹配可能靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)RAC1可能是miR-8的靶基因，miR-8 mimics轉(zhuǎn)染IOMM-Lee細(xì)胞后，RAC1表達(dá)明顯減少，雙熒光素酶結(jié)果也證實(shí)了miR-8通過(guò)與RAC1的3′UTR區(qū)結(jié)合，下調(diào)靶基因RAC1的表達(dá)。RAC1的主要作用是控制細(xì)胞生長(zhǎng)、重組細(xì)胞骨架，RAC1通過(guò)作用PAK1激活激酶，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重建，在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架集合和解離過(guò)程中起重要作用〔20〕；RAC1通過(guò)在G1期調(diào)節(jié)周期蛋白D1，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程〔21〕，本實(shí)驗(yàn)中，miR-8 mimics轉(zhuǎn)染IOMM-Lee細(xì)胞后，RAC1表達(dá)明顯減少，細(xì)胞的增殖受到抑制、細(xì)胞克隆數(shù)目減少，表明miR-8可能通過(guò)下調(diào)靶基因RAC1表達(dá)，從而抑制IOMM-Lee腦膜瘤細(xì)胞增殖。

綜上，miR-8在腦膜瘤組織中的低表達(dá)，miR-8通過(guò)與靶基因RAC1的3′UTR區(qū)結(jié)合，下調(diào)靶基因RAC1的表達(dá)，從而抑制IOMM-Lee腦膜瘤細(xì)胞增殖，為腦膜瘤發(fā)病機(jī)制的研究提供新的研究方向。