高詠梅 仵妍 徐暉 周曉 魯強

(1青島大學附屬青島海慈醫(yī)療集團婦科，山東 青島 266000；2山東大學第二附屬醫(yī)院婦科)

據(jù)世界衛(wèi)生局數(shù)據(jù)估算，每年宮頸癌新增病例有近53萬之多，80%的宮頸癌患者來自發(fā)展中國家〔1～3〕。宮頸癌早期沒有明顯癥狀及特殊體征，易被誤診、漏診，確診時常為中晚期。晚期宮頸癌主要采用單獨放療或放療結(jié)合化療治療〔4,5〕。接受根治性放療的患者仍有轉(zhuǎn)移和復發(fā)，且單獨放療預后不佳。因此如何預測宮頸癌的放療敏感性，采用放療聯(lián)合其他方法增強宮頸癌的治療效果是研究的重點。近年來宮頸癌增敏治療引起研究者的極大關注，即抗癌藥物作為放射增敏劑，對放射產(chǎn)生的生物效應進行修飾，增加射線對腫瘤組織的敏感性。芒柄花黃素是一種異黃酮類植物雌激素，廣泛存在于甘草、葛根、紅三軸草等豆科植物中，具有抗腫瘤活性〔6～10〕，但是否可以作為新的放射增敏劑提高宮頸癌療效尚未見報道。本文主要研究芒柄花黃素對宮頸癌細胞的放射增敏作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人宮頸癌細胞系HeLa細胞購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640細胞培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素為Hyclone公司產(chǎn)品；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；FITC-膜聯(lián)蛋白(Annexin)V、碘化丙啶(PI)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司；芒柄花黃素購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司；兔源Ki-67多克隆抗體、β-actin抗體及酶標二抗均為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific公司；0.25%胰蛋白酶溶液購自HyClon公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純；醫(yī)用直線加速器購自Siemens公司；680全自動酶標儀、流式細胞儀購自BD公司，其他常用試劑購自上海生工公司。

1.2 HeLa細胞的復蘇及培養(yǎng) 將液氮凍存的HeLa細胞于37℃水浴鍋中快速解凍，無菌操作將細胞轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，加入10 ml RPMI1640培養(yǎng)基，室溫下600 r/min離心10 min，棄上清，用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，細胞培養(yǎng)在含10%新小牛血清、青/鏈霉素各100 U/ml的RPMI1640培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃，飽和濕度下培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行試驗。

1.3 細胞照射 收集藥物處理后的HeLa細胞，X線垂直照射細胞，輻射劑量為0、2、4、6、8 Gy，檢測細胞凋亡的輻射量選擇4 Gy，照射后細胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 MTT法檢測HeLa細胞的增殖 取對數(shù)生長期的HeLa細胞加入含有芒柄花黃素(終濃度為10 μmol/L)的RPMI1640培養(yǎng)基，每個濃度設置6個復孔，以不加芒柄花黃素的HeLa細胞為對照組，然后進行X線照射，輻射劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，收集細胞消化并稀釋，以2×105/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml)作用3 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO放入搖床至完全溶解甲臜，震蕩搖勻后，檢測每孔細胞在490 nm的吸收值。計數(shù)增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.5 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的HeLa細胞進行輻射劑量分別為0、2、4、6、8 Gy的照射后，加入含有芒柄花黃素(終濃度為10 μmol/L)的RPMI1640培養(yǎng)基，以不加芒柄花黃素的HeLa細胞為對照組，培養(yǎng)48 h后收集細胞，將各組單細胞懸液接種到6孔板中，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，甲醇固定后，用結(jié)晶紫染色并于顯微鏡下進行集落計數(shù)(>50個細胞的集落為有效集落)，計算克隆形成率及根據(jù)單擊多靶模型擬合細胞存活曲線。

1.6 流式細胞儀檢測HeLa細胞凋亡 取對數(shù)生長期的HeLa細胞加入含有芒柄花黃素(終濃度為10 μmol/L)的RPMI1640培養(yǎng)基，以不加芒柄花黃素的HeLa細胞為對照組，然后進行輻射劑量為4 Gy的照射后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細胞，將細胞消化計數(shù)并接種到6孔板中，PBS清洗3次，加入500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105/孔，各孔加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，室溫避光反應10 min后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 Western印跡檢測Ki-67的表達 按流式細胞儀檢測凋亡的實驗方法分組處理，將照射后的HeLa細胞消化并離心收集，加入RIPA使細胞裂解，超聲波破碎后離心收集蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。每個樣本取50 μg進行12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，將分離后的蛋白進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入Ki-67一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育1 h。電化學發(fā)光(ECL)顯影檢測蛋白表達。

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗或方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 芒柄花黃素對放療后HeLa細胞增殖的影響 輻射劑量為0、2、4、6、8 Gy時，芒柄花黃素聯(lián)合放療組HeLa細胞增殖抑制率明顯高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組不同放療劑量細胞增殖抑制率比較

2.2 芒柄花黃素對放療后HeLa細胞克隆形成率的影響 芒柄花黃素聯(lián)合放療組2、4、6、8 Gy時HeLa細胞克隆形成率明顯低于對照組(P<0.05)。見表2。對克隆形成實驗數(shù)據(jù)進行曲線擬合，發(fā)現(xiàn)芒柄花黃素聯(lián)合放療組具有較高的放療敏感性，曲線參數(shù)見表3。

2.3 芒柄花黃素對放療后HeLa細胞凋亡的影響 芒柄花黃素聯(lián)合放療組HeLa細胞凋亡率明顯高于對照組〔(40.59±4.06)% vs (28.54±2.84)%，P<0.05〕。

2.4 芒柄花黃素對放療后HeLa細胞Ki-67表達的影響 芒柄花黃素聯(lián)合放療組的Ki-67蛋白表達量較對照組明顯提高(0.82±0.08 vs 0.44±0.05，P<0.05)。見圖1。

表2 兩組不同放療劑量細胞克隆形成率比較

表3 兩組克隆形成實驗單擊多靶模型的參數(shù)值(n=9)

圖1 Western印跡檢測后HeLa細胞Ki-67蛋白表達

3 討 論

宮頸癌是婦科腫瘤中的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的健康和生命?，F(xiàn)在生活節(jié)奏的加快使宮頸癌的發(fā)病年齡日趨年輕化，對患者造成沉重的生活壓力，已經(jīng)成為亟待解決的社會問題〔11〕。對于宮頸癌的治療，手術和輔助放療依然是最常用的治療手段〔12〕。影響放療的最主要因素是實體瘤存在乏氧細胞，其對放射線的耐受比氧細胞強2.5～4倍，造成常規(guī)放療不能殺死這些細胞，限制了放療的效果，是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源〔13〕。利用抗癌藥增加生物體的放療敏感性，提高腫瘤治愈率，對臨床治療具有重要意義。

紫杉醇、多西他賽、砒霜、羥基喜樹堿和芒柄花黃素等均為抗癌類藥物，研究發(fā)現(xiàn)很多抗癌藥可以提高腫瘤的放療敏感性。Jin等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)抗癌藥紫杉醇和SR-2508結(jié)合使用可以提高宮頸癌HeLa細胞的放療敏感性；Pradier等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)多西他賽使宮頸癌CaSki細胞的G2/M期細胞比例明顯提高，提高對宮頸癌CaSki細胞的放療增敏效果；As2O3是中藥砒霜的主要成分，Chun等〔16〕發(fā)現(xiàn)As2O3通過抑制HeLa細胞的亞致死損傷的修復，改變細胞周期，誘導細胞凋亡，提高宮頸癌細胞的放療敏感性；周斌等〔17〕研究表明羥基喜樹堿對HeLa細胞具有放療增益作用，其增益作用有時序、濃度和時間依賴性。

芒柄花黃素是一種具有類雌二醇分子結(jié)構(gòu)的異黃酮化合物，通常具有預防心血管疾病、清除氧自由基、抗癌、舒緩婦女更年期癥狀、預防骨質(zhì)疏松等保健作用〔18〕。研究表明芒柄花黃素對前列腺癌〔6〕、乳腺癌〔7,9〕、宮頸癌〔10〕等均有抑制作用，本研究中結(jié)果表明經(jīng)過放療處理后，芒柄花黃素可以明顯抑制HeLa細胞的增殖，促進HeLa細胞的凋亡，明顯降低HeLa細胞的克隆形成率，細胞增殖相關蛋白Ki-67的蛋白表達量也明顯提高。綜上可知，芒柄花黃素可以顯著提高宮頸癌細胞的放療敏感性，是宮頸癌潛在的放療增敏劑，對提高宮頸癌細胞的放療治療效果具有重要意義。