曹卉 高元慧 鄭琳麟 劉克輝 黃鄧高

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 1中心實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570208;2放射科)

近年來(lái)，惡性腫瘤的免疫治療是腫瘤治療研究熱點(diǎn)。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性(CIK) 細(xì)胞是一群非組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性的、有效抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞〔1〕。CIK細(xì)胞在體外具有較高的腫瘤細(xì)胞毒活性、廣譜的腫瘤靶點(diǎn)和對(duì)正常組織的低毒作用，且其對(duì)部分腫瘤有確切療效，目前在臨床過(guò)繼免疫治療中有廣泛應(yīng)用〔2～4〕。研究顯示〔5〕，CIK細(xì)胞能夠作為一種細(xì)胞載體作用于腫瘤組織。通過(guò)體內(nèi)觀察CIK細(xì)胞的增殖、分布、靶向等生物學(xué)行為可以為研究CIK細(xì)胞抗腫瘤作用機(jī)制提供一些線(xiàn)索。然而，自體CIK治療效果仍不盡人意，具體作用機(jī)制仍不明確，體內(nèi)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察CIK細(xì)胞的作用效應(yīng)仍然是目前研究的難點(diǎn)。

熒光素酶(Luc)是目前應(yīng)用最廣泛的活體生物發(fā)光成像報(bào)告基因之一，Luc標(biāo)記的生物發(fā)光現(xiàn)象可在活細(xì)胞內(nèi)被觀測(cè)，且發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目呈正比，用其標(biāo)記細(xì)胞后，通過(guò)活體成像系統(tǒng)可直接觀察標(biāo)記細(xì)胞在小動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等情況〔6，7〕。本研究擬構(gòu)建Luc-GFP-CIK細(xì)胞系，為進(jìn)一步探討小鼠體內(nèi)觀察CIK細(xì)胞治療腫瘤，標(biāo)記細(xì)胞的分布及靶向示蹤提供細(xì)胞來(lái)源，為腫瘤治療的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠(廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，SCXK(粵)2013-0002)，6～8 w，體重18～22 g。

1.2 細(xì)胞及主要試劑及儀器 293T細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所)，胎牛血清(FBS，BI公司)；無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基(BI公司)；重組人干擾素(IFN)-γ、重組人白細(xì)胞介素(IL)-2、重組人IL-1α均購(gòu)自上海生工；CD3 單克隆抗體(廣州BD公司)；抗小鼠CD3-FITC抗體、抗小鼠自然殺傷(NK)1.1-PE抗體(廣州BD公司)；螢火蟲(chóng)Luc底物(美國(guó)，Caliper公司)；手持細(xì)胞計(jì)數(shù)器(加拿大，Intelligent-Nano公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)，Thermo)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(瑞士，羅氏公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)，BD公司)；小動(dòng)物成像系統(tǒng)IVIS Spectrum(美國(guó)，PE公司)；引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成；測(cè)序工作由南京思普金生物科技有限公司完成。

1.3 脾細(xì)胞分離 采用斷頸法處死小鼠，置于75%乙醇中浸泡3 min，小鼠移至超凈臺(tái)無(wú)菌平皿中，剖開(kāi)皮膚層，酒精棉球擦拭肌肉層，挑起肌肉層剪開(kāi)后用止血鉗固定，暴露并取出脾臟，在無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中去除脂肪及膜組織，剪切并碾碎脾臟組織，無(wú)血清1640培養(yǎng)基重懸后，過(guò)篩網(wǎng)(400目)收集濾過(guò)液，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，室溫靜置5 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清，加入6 ml完全培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+10%FBS+1%青鏈霉素)，重懸細(xì)胞，2 000 r/min離心10 min，棄上清，加入2 ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.4 CIK細(xì)胞培養(yǎng) 按2×106個(gè)/ml將細(xì)胞接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，加入1 000 U/ml重組人IFN-γ后置于5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)；24 h后加入50 ng/ml CD3單克隆抗體、300 U/ml重組人IL-2和100 U/ml的重組人IL-1α；每3天半量換液并補(bǔ)加重組人IL-2；第14天收獲CIK細(xì)胞。

1.5 CIK細(xì)胞表型檢測(cè) 取1×105個(gè)CIK細(xì)胞，加入抗小鼠CD3-FITC抗體、抗小鼠NK1.1-PE抗體，4℃避光孵育15 min后，1 000 r/min離心5 min，PBS洗3次，離心、棄上清，加入200 μl固定液，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)、分析，鑒定CIK細(xì)胞。

1.6 目的基因獲得 根據(jù)Luc的DNA序列和pCD513B-1的MCS位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，Luc正義引物：5′-CCGGAATTCGCCACCATGACTTCGAAAGT TTATGATCCAG-3′，Luc反義引物：5′-CGCGGATCCTCATTGTTCATTTTTGAGAACTCGC-3′，擴(kuò)增片段1 144 bp。

1.7 pCD513B-1-Rluc的構(gòu)建與鑒定 20 μl體系下37℃反應(yīng)過(guò)夜，EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切pCD513B-1載體，通過(guò)T4 DNA連接酶，將PCR產(chǎn)物與雙酶切后pCD513B-1質(zhì)粒的10 μl體系在22℃條件下反應(yīng)16 h。取10 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入200 μl新鮮制備的感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴1 h，42℃熱激90 s，冰浴5 min，加入600 μl 37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)液，于37℃、220 r/min振搖1 h，離心后全部涂于含50 μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取4個(gè)菌落增菌培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。菌落經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性克隆者進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 病毒的包裝與檢測(cè) 轉(zhuǎn)染前24 h，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞用無(wú)抗生素DMEM+10%FBS重懸后接種6孔板，2 ml/孔。待第2天細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%融合度時(shí)，用配置好的質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物對(duì)6孔板中液體進(jìn)行半量換液。培養(yǎng) 6～10 h后，棄掉含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，以正常培養(yǎng)液DMEM+10%FBS進(jìn)行換液并從此刻開(kāi)始計(jì)算轉(zhuǎn)染時(shí)間。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率；轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞上清液，3 000 r/min離心20 min，去除細(xì)胞沉淀，0.45 μm濾器過(guò)濾，2 000 r/min離心濃縮后分裝于-80℃貯存。取其中一支病毒液1 μl加入已接種293T細(xì)胞的3.5 cm小皿中，6 h后半量換液，過(guò)夜后全量換液，24 h后熒光顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算病毒滴度。根據(jù)表達(dá)GFP的293T細(xì)胞數(shù)目計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的病毒滴度。

1.9 CIK細(xì)胞病毒感染、篩選及單克隆化 取第14天CIK細(xì)胞，加入病毒顆粒(MOI=3)，37℃培養(yǎng)6 h后半量換液，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后全量換液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測(cè)到熒光表達(dá)后加入嘌呤霉素(終濃度1.2 μg/ml)培養(yǎng)24 h，小心吸取上層細(xì)胞至新培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)，3 d后計(jì)數(shù)并稀釋至10個(gè)細(xì)胞/ml，按100 μl/孔加至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)(完全培養(yǎng)基+300 U/ml重組人IL-2)，6 d后吸取狀態(tài)較好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至3.5 cm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)(約12 d逐漸長(zhǎng)滿(mǎn)，期間每3 d半量換液并補(bǔ)加重組人IL-2)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后進(jìn)行Luc活性檢測(cè)。

1.10 Luc活性測(cè)定 取感染后的細(xì)胞2×106個(gè)離心棄上清，用新鮮配置含有底物的200 μl完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻，將200 μl細(xì)胞懸液接種至96孔板中，進(jìn)行等比稀釋。室溫靜止5 min，在Xenogen IVIS Spectrum 成像系統(tǒng)中采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1 脾臟CIK細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 脾臟單個(gè)核細(xì)胞在多種細(xì)胞因子作用下均處于增殖狀態(tài)，培養(yǎng)前3 d細(xì)胞小，數(shù)量少；第6天開(kāi)始細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始倍增，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞飽滿(mǎn)、聚集成團(tuán)，呈集落樣生長(zhǎng)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，集落數(shù)增多，細(xì)胞呈簇狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)取第14天細(xì)胞。

2.2 CIK細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果 新鮮脾臟細(xì)胞由0.054% CD3+NK1.1-，0.000%CD3-NK1.1+，0.140% CD3+NK1.1+組成；第3天由2.120% CD3+NK1.1-，0.420%CD3-NK1.1+，2.640% CD3+NK1.1+組成；第7天由6.100% CD3+NK1.1-，0.860%CD3-NK1.1+，9.240% CD3+NK1.1+組成；第14天由23.400% CD3+NK1.1-，4.190%CD3-NK1.1+，43.000% CD3+NK1.1+組成，見(jiàn)圖2。

圖1 CIK細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果(×200)

圖2 CIK細(xì)胞表型鑒定結(jié)果

2.3 慢病毒表達(dá)載體的酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果 載體pCD513B-1用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切，PCR擴(kuò)增，得到一條約1 100 bp的條帶(圖3)，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與Luc序列一致。

1.DNA Maker；2.未經(jīng)酶切；3.雙酶切后圖3 載體酶切電泳

2.4 病毒感染結(jié)果 慢病毒感染24 h后，熒光顯

微鏡下實(shí)驗(yàn)組及單克隆株組CIK細(xì)胞均表達(dá)GFP，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞GFP表達(dá)水平高于單克隆株組細(xì)胞，見(jiàn)圖4。

圖4 重組慢病毒感染CIK細(xì)胞后GFP表達(dá)的鏡下結(jié)果(×100)

2.5 Luc活性測(cè)定 活體成像系統(tǒng)下，檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組生物發(fā)光信號(hào)隨著細(xì)胞數(shù)量的減少，發(fā)光強(qiáng)度下降，見(jiàn)圖5。

A1孔接種細(xì)胞1×106個(gè)，A2孔接種細(xì)胞5×105個(gè)圖5 重組慢病毒感染CIK細(xì)胞后活體成像系統(tǒng)下Luc發(fā)光檢測(cè)

3 討 論

過(guò)繼免疫療法是通過(guò)回輸體外擴(kuò)增并激活的免疫細(xì)胞，如CIK、NK細(xì)胞及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，以消除腫瘤細(xì)胞的一種方法〔8，9〕。有研究顯示，CIK細(xì)胞可通過(guò)體外培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞并定期添加CD3抗體及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2培養(yǎng)超過(guò)2 w來(lái)獲得〔9〕。CIK細(xì)胞是一種異質(zhì)細(xì)胞群，本實(shí)驗(yàn)從小鼠脾臟組織成功分離培養(yǎng)CIK細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)鑒定顯示其構(gòu)成比例主要由CD3+CD56+和CD3+CD56-及少部分CD3-CD56+細(xì)胞組成，與已報(bào)道文獻(xiàn)一致〔10〕。本次培養(yǎng)脾臟來(lái)源的CIK細(xì)胞，細(xì)胞量大，增殖速度快，第6天開(kāi)始細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始倍增，聚集成團(tuán)，呈集落樣生長(zhǎng)，2 w左右即可獲得所需的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。CIK有較好的臨床應(yīng)用前景，但大多側(cè)重于患者生存期的比較，具體的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用尚未明確。CIK是如何歸巢并作用于腫瘤細(xì)胞、如何產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)鮮見(jiàn)報(bào)道。Kim等〔11〕在體外利用延時(shí)成像的方法對(duì)殺死單個(gè)腫瘤細(xì)胞所需的CIK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，為腫瘤患者CIK細(xì)胞免疫治療的合理設(shè)計(jì)提供線(xiàn)索，提出在體內(nèi)優(yōu)化CIK細(xì)胞的活性并使其歸向腫瘤微環(huán)境可能是增加效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的關(guān)鍵。徐贊美等〔12〕采用Ad5F11p-GFP 對(duì)CIK和NK細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，探討了轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。但上述的課題組未進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)研究，無(wú)法證實(shí)在體內(nèi)CIK細(xì)胞的殺瘤活性是否與體外一致。另有學(xué)者報(bào)道〔13〕，利用表達(dá)GFP及Luc的肝癌細(xì)胞株構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)發(fā)光的肝癌細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)來(lái)間接評(píng)價(jià)CIK細(xì)胞在體內(nèi)外的殺瘤活性。這種方法在體內(nèi)能夠?qū)?biāo)記的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行直觀觀察，并測(cè)量體內(nèi)腫瘤的大小來(lái)側(cè)面評(píng)價(jià)CIK細(xì)胞的活性。提示GFP及Luc可同時(shí)標(biāo)記于同一細(xì)胞，可通過(guò)活體成像系統(tǒng)在體內(nèi)實(shí)時(shí)追蹤和觀察。

普通細(xì)胞沒(méi)有光學(xué)特性，移植入動(dòng)物體內(nèi)不可觀察。通過(guò)體外特異性標(biāo)志物標(biāo)記后的細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)活體內(nèi)成像。小動(dòng)物活體成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光和熒光兩種技術(shù)，使用生物發(fā)光成像的技術(shù)來(lái)進(jìn)行發(fā)光驗(yàn)證，主要原因?yàn)椋荷锇l(fā)光成像避免了動(dòng)物本身自發(fā)熒光的干擾，這一技術(shù)利用Luc標(biāo)記細(xì)胞或遺傳物質(zhì)，加入底物熒光素后可以發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，利用小動(dòng)物活體成像進(jìn)行生物發(fā)光信號(hào)的采集。有報(bào)道〔14〕將轉(zhuǎn)基因小鼠GFP+C57BL/6與Luc+FVB-L2G85進(jìn)行回交，取第十代B6-L2G85小鼠的脾臟進(jìn)行原代培養(yǎng)，能夠獲取同時(shí)表達(dá)GFP及Luc的CIK細(xì)胞，并且在體內(nèi)對(duì)CIK細(xì)胞的移植物抗宿主病(GVHD)的作用展開(kāi)了深入研究。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行操作獲取GFP-Luc-CIK細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因小鼠價(jià)格昂貴，不容易獲取，并且需要有專(zhuān)業(yè)的遺傳背景知識(shí)進(jìn)行指導(dǎo)，操作難度大、周期長(zhǎng)。本次實(shí)驗(yàn)在體外利用慢病毒感染的方式對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，成本較低，操作簡(jiǎn)便、周期較短，或許可以作為替代實(shí)驗(yàn)解決轉(zhuǎn)基因小鼠獲取困難、成本很高、操作復(fù)雜這一難題。CIK細(xì)胞具有體外易于擴(kuò)增、對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的非MHC限制的殺傷活性等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注〔15～17〕。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的Luc-GFP-CIK細(xì)胞株能夠解決研究條件有限不能從轉(zhuǎn)基因鼠獲取源細(xì)胞的問(wèn)題，為小動(dòng)物體內(nèi)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察CIK細(xì)胞的分布及靶向治療腫瘤、評(píng)價(jià)CIK細(xì)胞的殺瘤活性提供細(xì)胞來(lái)源。