王斌 呂錦 孔敏 王虎

(1成都市第一人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610041；2四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院放射科)

非編碼RNA約占人類基因組的98%，其中包括長鏈非編碼RNA(LncRNA)和短鏈非編碼RNA(miRNA)〔1〕。LncRNA為長度在200個核苷酸以上的非編碼RNA，miRNA的長度在19～25個核苷酸，兩者均可通過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平及表觀遺傳調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔2〕。自噬為真核細(xì)胞的自身降解過程，與機(jī)體衰老、神經(jīng)退行性疾病、肥胖及癌癥均具有密切關(guān)系〔3〕。大量研究證實，自噬在腫瘤中具有雙重作用，在腫瘤的不同階段發(fā)揮不同作用。非編碼RNA核富集的轉(zhuǎn)錄物(NEAT)1為新發(fā)現(xiàn)的一種Lnc RNA〔4〕，在口腔鱗癌中的作用機(jī)制尚未完全清楚。miRNA(miR)-520b在不同癌癥中發(fā)揮不同作用〔5，6〕，其在口腔鱗癌中的作用尚未完全清楚。本研究擬以口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113為研究對象，觀察抑制NEAT1、過表達(dá)miR-520b、抑制miR-520b對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響，為口腔鱗癌的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113、人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞HOEC，均購自美國菌種保存中心(ATCC)；達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、四唑鹽(MTT)、胰蛋白酶，均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自大連Takara公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液，均購自碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自美國Promega公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Tca8113、HOEC，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將si-NC、si-NEAT1、miR-520b mimics、miR-NC、si-NEAT1+anti-miR-NC、si-NEAT1+anti-miR-520b按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書操作步驟要求轉(zhuǎn)染至Tca8113細(xì)胞，分別標(biāo)記為si-NC組、si-NEAT1組、miR-520b組、miR-NC組、si-NEAT1+anti-miR-NC組、si-NEAT1+anti-miR-520b組，轉(zhuǎn)染48 h后，采用qRT-PCR實驗檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗。

1.2.3 qRT-PCR實驗 取適量對數(shù)生長期1.2.2各組細(xì)胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求提取RNA，進(jìn)行定量，然后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作合成cDNA。最后按照qRT-PCR試劑盒說明書檢測miR-520b、NEAT1。用2-△△Ct計算miR-520b、NEAT1的表達(dá)水平。

1.2.4 MTT實驗 取適量1.2.2各組細(xì)胞，加入5 g/L的MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞的增殖力與細(xì)胞活力呈正比。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)實驗 取適量1.2.2各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液500 μl懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl的 Annexin V-FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。細(xì)胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.6 Western印跡實驗 收集1.2.2各組細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，。取上清置于EP管，加入5倍SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入一抗，4℃過夜孵育，洗膜，加二抗，4℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 取適量對數(shù)生長期1.2.2各組細(xì)胞，遵照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊要求操作。psiCHECK2載體以螢火蟲熒光素酶活性為內(nèi)參，psiCHECK2-NEAT1-3′UTR WT和psiCHECK2-NEAT1-3′UTR MUT的表達(dá)為對照，轉(zhuǎn)染24 h后，檢測熒光強(qiáng)度。海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值即反映miR-520b與NEAT1的結(jié)合力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-

q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 NEAT1和miR-520b在人口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中的表達(dá) 與HOEC組相比，Tca8113組細(xì)胞中NEAT1表達(dá)顯著升高，miR-520b表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 NEAT1和miR-520b在Tca8113細(xì)胞和HOEC細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 抑制NEAT1對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-NEAT1組Tca8113細(xì)胞中NEAT1表達(dá)顯著降低，48、72 h時細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 抑制NEAT1表達(dá)對Tca8113細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 抑制NEAT1表達(dá)對Tca8113細(xì)胞自噬的影響 與si-NC組(0.36±0.04)相比，si-NEAT1組Tca8113細(xì)胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)量(1.07±0.08)顯著升高(t=13.749，P=0.000)。見圖1。

2.4 過表達(dá)miR-520b對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響 與miR-NC組相比，miR-520b組Tca8113細(xì)胞中miR-520b表達(dá)顯著升高，48、72 h時細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

圖1 抑制NEAT1表達(dá)對Tca8113細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ、Ⅱ表達(dá)的影響

表3 過表達(dá)miR-520b對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響

圖2 過表達(dá)miR-520b對Tca8113細(xì)胞LC3Ⅱ、Ⅰ表達(dá)的影響

2.5 NEAT1靶向miR-520b 運用miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-520b與NEAT1 3′UTR存在結(jié)合位點(圖3)；雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-520b組WT-NEAT1細(xì)胞中熒光活性顯著降低(miR-NC組：1.02±0.08，miR-520b組：0.41±0.05；t=11.199，P=0.000)，MUT-NEAT1細(xì)胞中熒光活性不受影響(miR-NC組：1.04±0.07，miR-520b組：0.98±0.09；t=0.912，P=0.414)。與pcDNA組(0.45±0.04)比較，pcDNA-NEAT1組miR-520b水平(0.21±0.03)顯著降低(P<0.05)；與si-NC組(0.42±0.05)比較，si-NEAT1組miR-52b水平(1.04±0.06)顯著升高(P<0.05)。

2.6 抑制miR-520b和抑制NEAT1對Tca8113細(xì)

胞增殖、凋亡和自噬的影響 與si-NEAT1+anti-miR-NC組相比，si-NEAT1+anti-miR-520b組Tca8113細(xì)胞在48、72 h細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表4。

圖3 NEAT1的3′UTR中含有與miR-520b互補(bǔ)的核苷酸序列

1～4分別為：si-NC；si-NEAT1；si-NEAT1+anti-miR-NC；si-NEAT1+anti-miR-520b圖4 LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)

表4 抑制miR-520b和抑制NEAT1對口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響

3 討 論

NEAT1在許多人類癌癥中起關(guān)鍵作用〔7，8〕，與機(jī)體多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔9〕。大量研究證實，自噬在人類的多種腫瘤中存在異常，發(fā)揮抑制或促進(jìn)腫瘤的作用〔10～12〕。Liu等〔13〕在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的研究發(fā)現(xiàn)，與鄰近的非腫瘤組織和正常口腔角質(zhì)形成細(xì)胞相比，鱗癌組織和細(xì)胞系中NEAT1的表達(dá)顯著升高，且與患者的晚期臨床分期和較短的存活時間顯著相關(guān)，抑制NEAT1表達(dá)導(dǎo)致鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲顯著減少，伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表達(dá)的減少，miR-365的抑制消除了敲低NEAT1對鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，提示NEAT1通過抑制miR-365促進(jìn)OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲，NEAT1可能為治療鱗癌的潛在靶點。Huang等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)異常升高，且可負(fù)向調(diào)控低表達(dá)的miR-365，敲除NEAT1可抑制細(xì)胞增殖和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期和細(xì)胞凋亡，而抑制miR-365消除了敲低NEAT1對細(xì)胞過程的抑制作用，且 RGS20是miR-365的直接靶標(biāo)，可通過增強(qiáng)細(xì)胞活力和運動性逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-365的腫瘤抑制作用，此外，RGS20、細(xì)胞周期蛋白D1、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)可通過NEAT1/miR-365通路調(diào)節(jié)，沉默NEAT1也可抑制體內(nèi)腫瘤生長，揭示了NEAT1/miR-365/RGS20通路可能是OSCC治療的新策略。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tca8113細(xì)胞中NEAT1表達(dá)顯著升高，且抑制NEAT1可抑制Tca8113細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，這與Liu等〔13〕、Huang等〔14〕的研究結(jié)果相一致；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制NEAT1能促進(jìn)Tca8113細(xì)胞的自噬。

miRNA失調(diào)或功能障礙會促進(jìn)或抑制癌癥的發(fā)展〔15，16〕。miR-520b在多種腫瘤中表達(dá)異常，其在卵巢癌中發(fā)揮促癌作用〔17〕，在膀胱癌中發(fā)揮抑癌作用〔18〕。梁雪〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-520b可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的自噬，且過表達(dá)miR-520b可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Jin等〔20〕發(fā)現(xiàn)，miR-520b過表達(dá)明顯抑制了體外肺癌細(xì)胞增殖，抑制miR-520b能夠加速肺癌細(xì)胞的增殖，敲低HDAC4逆轉(zhuǎn)了抑制miR-520b誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，且在臨床人肺癌樣品中觀察到miR-520b和HDAC4之間的負(fù)相關(guān)，提示MiR-520b降低HDAC4表達(dá)以控制肺癌細(xì)胞的增殖。Cui等〔21〕發(fā)現(xiàn)miR-520b在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，且miR-520b可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝、侵襲、血管生成和化學(xué)敏感性，其機(jī)制與直接靶向負(fù)調(diào)控MBD2有關(guān)，提示miR-520b在膠質(zhì)瘤中具有腫瘤抑制劑的作用。Lu等〔22〕在頭頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-520b可通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲，并增加癌細(xì)胞對藥物和輻射治療的敏感性，其機(jī)制與miR-520b靶向調(diào)控CD44有關(guān)，提示miR-520b為難治性HNC治療的新靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-520b在口腔鱗癌細(xì)胞中表達(dá)異常降低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-520b可抑制Tca8113細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡和自噬；雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證，NEAT1靶向負(fù)調(diào)控miR-520b，且抑制miR-520b可逆轉(zhuǎn)抑制NEAT1對Tca8113細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。綜上所述，NEAT1可促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖并抑制凋亡和自噬，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-520b有關(guān)，為口腔鱗癌的診斷、預(yù)防和治療提供了新的靶點。