湯曉琳 楊丹 呂鑫 沈薇

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2藥理教研室；3 2018屆臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)；4病理生理教研室)

正常上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)脫離黏附后，細(xì)胞與基質(zhì)相互作用消失，發(fā)生失巢凋亡(anoikis)。腫瘤對(duì)失巢凋亡的抵抗能力在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。胃癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤，預(yù)后較差，其5年生存率僅為20%～30%〔1〕，胃癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的最主要原因。研究表明，分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)1在胃癌中呈低表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后相關(guān)〔2〕。有報(bào)道SFRP1甲基化致基因沉默促進(jìn)胃癌的形成和發(fā)展〔3〕，但關(guān)于SFRP1對(duì)細(xì)胞失巢凋亡的影響及其機(jī)制尚少報(bào)道。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)胃黏膜上皮細(xì)胞(GES)-1為失巢凋亡敏感細(xì)胞〔4〕，本研究應(yīng)用RNA干擾沉默GES-1中SFRP1表達(dá)，觀察其對(duì)GES-1細(xì)胞失巢凋亡敏感性的影響，并探討其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人GES-1(武漢普諾賽公司)。RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Corning公司)；胎牛血清(美國(guó)Gemini公司)；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(天津?yàn)笊镉邢薰?；SFRP1基因siRNA(上海吉瑪基因公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)；RNA提取試劑盒(美國(guó)Axygen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Q-PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司)；多聚α-羥乙基甲基丙烯酸酯(Poly-HEMA，美國(guó)Sigma公司)；凋亡檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；CytoSelectTM24-Well Anoikis Assay(美國(guó)Cell Biolabs公司)。兔多克隆抗體SFRP1(美國(guó)Abcam公司)；鼠單克隆抗體β-catenin 抗體、β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠和山羊抗兔IgG，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國(guó)Proteintech公司)；紅色熒光素(RRX)標(biāo)記山羊抗兔IgG(中國(guó)康為世紀(jì)公司)；4′6-二脒基-乙-苯基吲哚(DAPI)染液、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 GES-1培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。針對(duì)SFRP1不同位點(diǎn)的三組siRNA基因序列及對(duì)照組Control siRNA序列如下：siRNA-612正義：5′-GCUCAACAAGAACUGCCACTT-3′，反義：GUGGCAGUUCUUGUUGAGCTT-3′；siRNA-891正義：5′-GAAAUCUGAGGCCAUCAUUTT-3′，反義：5′-AAUGAUGGCCUCAGAUUUCTT-3′；siRNA-740正義：5′-UCAUGCAGUUCUUCGGCUUTT-3′，反義：5′-AAGCCGAAGAACUGCAUGATT-3′)；Control siRNA正義：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉(zhuǎn)染前24 h，將(1.5～2.0)×105個(gè)/ml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，每孔1 ml，培養(yǎng)過(guò)夜。第2天用脂質(zhì)體包埋的siRNA與細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。48 h后使用胰酶消化收集各組細(xì)胞進(jìn)行失巢培養(yǎng)。

1.2.2 失巢凋亡模型的建立 稱取1 g Poly-HEMA，加入10 ml無(wú)水乙醇，震蕩混勻，37℃水浴加熱至無(wú)顆粒狀態(tài)，濃度為10 mg/ml。取3 ml液體覆蓋于培養(yǎng)皿(60 mm)底部，在超凈臺(tái)內(nèi)吹干，室溫下待乙醇揮發(fā)使其自然凝固，重復(fù)操作2次，使用前磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞接種于Poly-HEMA包被的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞在培養(yǎng)皿中非黏附生長(zhǎng)而呈懸浮狀態(tài)，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.3 Realtime RT-PCR檢測(cè) 處理后細(xì)胞提取總RNA，以O(shè)ligo dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈，然后以第一條cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：SFRP1正義：5′-GATGCTTAAGTGTGACAAGTTCCC-3′，反義：5′-TGGCCTCAGATTTCAAC TCGT-3′；GAPDH正義：5′-GCACCGTCAGGCTGAGAA-3′，反義：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG-3′；Cyclin D1正義：5′-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3′，反義：5′-CCACTTGAGCTTGTTCACCA-3′；c-Myc正義：5′-ACCAGATCCCGGAGTTGGAA-3′，反義：5′-CGTCGTTTCCGCAACAAGTC-3′。ABI 7500 Real-time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行操作，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，添加溶解曲線，計(jì)算平均值，最后以2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞失巢凋亡率 收集各組懸浮培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)失巢凋亡率。PBS洗滌并收集細(xì)胞，加入1倍Annexin V上樣緩沖液制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl碘化丙啶(PI)，室溫下避光孵育15 min，加入上樣緩沖液后上機(jī)檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5 Calcein AM/EthD-1熒光雙染法檢測(cè)失巢凋亡 轉(zhuǎn)染后各組懸浮培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，每孔分別加入1 μl Calcein AM(500×)和1 μl EthD-1(500×)，37℃孵育30～60 min，熒光倒置顯微鏡下觀察。Calcein AM呈綠色熒光，檢測(cè)活細(xì)胞的存在。EthD-1呈紅色熒光，檢測(cè)失巢凋亡細(xì)胞的存在。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞熒光強(qiáng)度的測(cè)定及分析。

1.2.6 軟瓊脂集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 軟瓊脂培養(yǎng)皿分為兩層，底層軟瓊脂濃度為0.5%，上層軟瓊脂濃度為0.3%。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，制成密度為10×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl鋪于軟瓊脂覆蓋的培養(yǎng)皿中，在37℃、5% CO2條件下孵育14 d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落的形態(tài)和數(shù)目，每組樣品隨機(jī)拍攝5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)集落數(shù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 失巢培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞懸液，稀釋濃度至15×104個(gè)/ml，取1 ml懸液鋪于共聚焦培養(yǎng)皿中，再加入1 ml培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。第二天棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min，棄掉甲醛用PBS漂洗；0.2%Triton室溫30 min進(jìn)行細(xì)胞透化；5%BSA封閉60 min后棄掉液體；一抗β-catenin(1∶200)孵育，4℃過(guò)夜。PBS漂洗3次，二抗紅色熒光RRX標(biāo)記IgG(1∶50)室溫避光孵育45 min，洗去二抗，加入DAPI染核(200 μl/皿)，室溫10 min，PBS漂洗后置于倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.8 Western印跡檢測(cè) 提取各組細(xì)胞總蛋白測(cè)量濃度并定量。一抗為SFRP1(1∶500)，β-catenin(1∶200)；β-actin (1∶1 000)。二抗為羊抗鼠IgG(1∶5 000)，羊抗兔IgG(1∶5 000)。10% SDS-PAGE電泳，電泳分離后將蛋白電濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PVDF)上，5% 過(guò)濾脫脂奶封閉1 h，4℃一抗孵育過(guò)夜，TBST洗3遍，每次10 min。加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，ECL發(fā)光顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS23.0軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 SFRP1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)GES-1細(xì)胞SFRP1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 針對(duì)SFRP1不同位點(diǎn)的3組SFRP1 siRNA及對(duì)照組Control siRNA分別轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞。與對(duì)照組設(shè)為1比較，siRNA-612組(0.47±0.09)及siRNA-891組SFRP1 mRNA表達(dá)(0.31±0.13)均明顯降低(P<0.01)。siRNA-740組sFRP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.89±0.09。Western印跡結(jié)果顯示，siRNA-891組SFRP1蛋白表達(dá)水平明顯降低(圖1)。提示SFRP1 siRNA-891成功轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞，顯著下調(diào)SFRP1基因和蛋白表達(dá)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用siRNA-891進(jìn)行。

2.2 降低SFRP1表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞失巢凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，siRNA-891組細(xì)胞失巢凋亡率〔(13.80±2.66)%〕較對(duì)照組〔(27.85±5.25)%〕明顯降低(P<0.05)。

Calcein AM/EthD-1熒光雙染法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組〔EthD-1:(21.98±9.18)%,Calcein AM:(11.63±0.68)%〕比較，siRNA-891組EthD-1紅色熒光染色的失巢凋亡細(xì)胞數(shù)目〔(6.64±1.42)%〕明顯減少，Calcein AM綠色熒光染色的存活細(xì)胞數(shù)目〔(32.10±7.88)%〕明顯增多(圖2)。Calcein AM和EthD-1熒光值分析顯示，siRNA-891組較對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。

圖1 SFRP1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)GES-1細(xì)胞SFRP1蛋白表達(dá)的影響

圖2 Calcein AM/EthD-1熒光雙染法檢測(cè)GES-1細(xì)胞失巢凋亡的變化(×20)

2.3 降低SFRP1表達(dá)對(duì)細(xì)胞非錨定生長(zhǎng)的影響 siRNA-891組與對(duì)照組相比，細(xì)胞集落明顯變大，細(xì)胞集落數(shù)量明顯增多〔對(duì)照組(13.3±4.04)個(gè)，siRNA-891組(25.67±2.08)個(gè)，P<0.05〕。見(jiàn)圖3。

圖3 SFRP1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)GES-1細(xì)胞非錨定生長(zhǎng)的影響(×20)

2.4 降低SFRP1表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白定位及表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，siRNA-891組β-catenin在細(xì)胞核中表達(dá)明顯增強(qiáng)。Western印跡結(jié)果顯示，siRNA-891組β-catenin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加。上述結(jié)果提示，降低SFRP1表達(dá)后Wnt通路激活，其通路中關(guān)鍵因子β-catenin表達(dá)增加(圖4)。

A:1,DAPI標(biāo)記細(xì)胞核；2,β-catenin-RRX熒光標(biāo)記；3,1和2的重疊影像;B:β-catenin蛋白表達(dá)結(jié)果圖4 SFRP1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)GES-1細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)及定位的影響(×20)

2.5 降低SFRP1表達(dá)對(duì)β-catenin靶基因c-Myc 和 CyclinD1表達(dá)的影響 與對(duì)照組(1.00±0.00)相比，siRNA-891組c-Myc mRNA(5.55±0.52)和CyclinD1 mRNA(2.48±0.22)表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

正常細(xì)胞依附ECM而存活稱為錨定依賴。當(dāng)正常上皮細(xì)胞與ECM失去黏附后，細(xì)胞與基質(zhì)相互作用消失，發(fā)生失巢凋亡。這種特殊的細(xì)胞死亡形式對(duì)于維持機(jī)體組織結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。腫瘤細(xì)胞可在錨著不依賴的條件下存活，獲得失巢凋亡抗性，進(jìn)而發(fā)生遷移，侵入ECM，通過(guò)血液循環(huán)擴(kuò)散到其他組織中增殖。因此，研究失巢凋亡的發(fā)生對(duì)揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制有重要意義。失巢凋亡與胃癌的關(guān)系近年來(lái)受到關(guān)注。有報(bào)道，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基因DBC1，α-fetoprotein，Claudin-1可阻止胃癌細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡〔5～7〕。但抑制腫瘤發(fā)展基因的表達(dá)與胃癌失巢凋亡的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

SFRPs 屬于分泌型糖蛋白家族，約有300個(gè)氨基酸，稱為分泌型卷曲相關(guān)蛋白。目前發(fā)現(xiàn)SFRP家族有7個(gè)成員，分別是SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、SARP3、sizzled及crescent,其中SFRP1在多種惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)或表達(dá)缺失。Zhang等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1表達(dá)缺失存在于原發(fā)性胃癌，并且與SFRP1高甲基化密切相關(guān)。Cheng等〔3〕發(fā)現(xiàn)SFRP1的表達(dá)缺失促進(jìn)胃癌發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。有報(bào)道人乳腺上皮細(xì)胞中SFRP1表達(dá)抑制促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并獲得局部浸潤(rùn)和遷移的特性〔8〕。肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SFRP1可降低細(xì)胞的增殖力和遷移力〔9〕。但SFRP1表達(dá)沉默在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制仍不十分清楚，SFRP1基因?qū)ξ干掀ぜ?xì)胞或胃癌細(xì)胞失巢凋亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組在前期研究中報(bào)道了GES-1為失巢凋亡敏感細(xì)胞〔4〕，本研究結(jié)果提示抑制SFRP1基因表達(dá)后，GES-1細(xì)胞失巢凋亡敏感性下降，進(jìn)而易獲得失巢凋亡抵抗的能力。細(xì)胞的錨定不依賴性生長(zhǎng)也可通過(guò)軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。有報(bào)道軟瓊脂形成集落數(shù)目越多，細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)〔10〕。單個(gè)細(xì)胞集落形成狀況反映了細(xì)胞抵抗失巢凋亡能力的高低〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SFRP1siRNA抑制SFRP1表達(dá)后，GES-1細(xì)胞集落形成數(shù)目顯著增多。上述結(jié)果證實(shí)抑制SFRP1基因表達(dá)使正常胃黏膜上皮細(xì)胞失巢凋亡敏感性顯著下降，SFRP1的表達(dá)對(duì)于維持胃黏膜上皮細(xì)胞失巢凋亡特性具有重要作用，提示胃癌中SFRP1表達(dá)缺失可能參與介導(dǎo)細(xì)胞獲得失巢凋亡抗性。

Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，蛋白通過(guò)自分泌或旁分泌作用與位于細(xì)胞膜上的Fz受體結(jié)合，通過(guò)其下游蛋白的磷酸化與去磷酸化過(guò)程來(lái)完成Wnt信號(hào)途徑的傳遞。Wnt通路的異?；罨c腫瘤形成密切相關(guān)，影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移〔12，13〕。有研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞中Wnt2的異常表達(dá)抑制細(xì)胞的失巢凋亡，在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生〔14〕。SFRP1基因結(jié)構(gòu)與Fz受體相似度可達(dá)30%～50%，具有同源的配體抑制區(qū)，故SFRP1可競(jìng)爭(zhēng)性抑制Fz受體，阻止Wnt與Fz結(jié)合或與Fz結(jié)合但形成無(wú)功能復(fù)合物，從而阻斷Wnt通路激活〔15，16〕。

Wnt通路激活時(shí)，胞質(zhì)中的β-catenin不被降解并持續(xù)活化，在細(xì)胞核中積聚，在細(xì)胞失巢凋亡抵抗中發(fā)揮重要作用〔17〕。Cho等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞中抑制SFRP1表達(dá)后，Wnt通路被激活，β-catenin表達(dá)增高。Gauger等〔8〕在乳腺上皮細(xì)胞中抑制SFRP1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)β-catenin表達(dá)增高，從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核并積聚。本研究得出相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)失巢培養(yǎng)的GES-1中抑制SFRP1表達(dá)后，細(xì)胞核中β-catenin表達(dá)明顯增多，β-catenin蛋白表達(dá)升高；抑制SFRP1表達(dá)后，c-Myc和cyclin-D1基因表達(dá)顯著增高。Dai等〔19〕報(bào)道沉默c-Myc表達(dá)促進(jìn)牙周韌帶細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡。Jiang等〔9〕發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SFRP1可降低CyclinD1表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。提示β-catenin的靶基因c-Myc和CyclinD1參與細(xì)胞失巢凋亡的調(diào)控，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)抑制SFRP1基因表達(dá)可降低EGS-1對(duì)失巢凋亡的敏感性，激活Wnt通路，β-catenin及其靶基因表達(dá)增高可能是其作用機(jī)制。本研究為SFRP1在胃癌發(fā)展中的作用及機(jī)制研究提供了新的思路和理論依據(jù)，提示SFRP1表達(dá)沉默誘導(dǎo)正常細(xì)胞獲得失巢凋亡抵抗的能力。