張?jiān)購(gòu)?qiáng) 丁家望 李相萱 汪心安 羅彩云 余彬 尚白雪

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

心血管疾病已經(jīng)成為女性死亡率升高的主要原因之一〔1〕。雖然傳統(tǒng)意義上心血管疾病更傾向于男性，但是隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展及人們對(duì)于心血管疾病的認(rèn)識(shí)程度不斷提高，男性心血管疾病死亡率在逐年降低，然而由于對(duì)女性心血管疾病的研究較少，發(fā)病率和死亡率仍然很高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前中國(guó)女性因心血管疾病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的1/3以上〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，女性急性冠脈綜合征患者在發(fā)病前大多數(shù)都有一段時(shí)間的睡眠質(zhì)量下降、情緒低落等影響生活質(zhì)量的情況，而這些改變都會(huì)導(dǎo)致人體正常的晝夜節(jié)律的改變〔3，4〕。本研究選取女性急性冠脈綜合征患者，并以同時(shí)間段入院的女性冠脈正常患者作為對(duì)照，探討女性晝夜節(jié)律紊亂與急性冠脈綜合征的發(fā)生及冠脈狹窄嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇宜昌市中心人民醫(yī)院2016年11月至2017年8月住院患者86例，分為:①女性冠脈正常組(A1組)20例；②女性不穩(wěn)定性心絞痛(A2)組32例；③女性急性心肌梗死(A3)組34例。根據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)及歐洲心臟病學(xué)會(huì)(ESC)，診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：正常組：冠脈造影顯示無(wú)冠脈血管病變。不穩(wěn)定性心絞痛：①無(wú)明顯心肌標(biāo)記物的升高；②有心肌缺血的癥狀；③心電圖表現(xiàn)出短暫的ST段壓低和(或)T波平坦、倒置或罕見(jiàn)的ST段抬高。急性心肌梗死：心肌標(biāo)記物〔肌鈣蛋白或肌酸激酶同工酶(CK-MB)〕超過(guò)正常上限的99%分位，同時(shí)具備下述診斷標(biāo)準(zhǔn)至少1條：①有心肌缺血的癥狀；②心電圖上新出現(xiàn)顯著的 ST-T 改變或左束支傳導(dǎo)阻滯；③心電圖出現(xiàn)病理性Q波；④冠脈造影提示冠脈狹窄。排除標(biāo)準(zhǔn)：①1年以?xún)?nèi)的心腦血管事件，如腦卒中、心肌梗死等；②低密度脂蛋白膽固醇 ≥4.3 mmol/L；③惡性腫瘤；④腎衰竭；⑤肝臟疾??；⑥自身免疫性疾病。受試者均行冠脈造影檢查且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，簽署知情同意書(shū)。

1.2 基本資料的收集 記錄入選患者的基本臨床資料，包括：年齡、體重指數(shù)(BMI)、糖尿病病史、高血壓病史、吸煙史、飲酒史等。

1.3 冠狀動(dòng)脈造影 采用荷蘭philips FD20型數(shù)字減影血管造影，選用Judkins法，經(jīng)股動(dòng)脈或橈動(dòng)脈，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)行冠狀動(dòng)脈造影。冠狀動(dòng)脈造影由2名心內(nèi)科介入醫(yī)師操作和分析。左冠狀動(dòng)脈造影至少?gòu)?個(gè)角度造影，右冠狀動(dòng)脈至少?gòu)?個(gè)角度造影。同時(shí)記錄冠狀動(dòng)脈病變的部位。Gensini評(píng)分〔5〕：冠狀動(dòng)脈狹窄程度的分析根據(jù)AHA規(guī)定的采用Gensini積分系統(tǒng)，對(duì)每支血管進(jìn)行定量評(píng)分，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)由兩部分組成：①根據(jù)冠脈狹窄程度確定基本評(píng)分：無(wú)任何狹窄的0分；狹窄程度<25%，1分；≥25%且<50%，2分；≥50%且<75%，4分；≥75%且<90%，8分；≥90%且<99%，16分；≥99%，32分。②根據(jù)冠狀動(dòng)脈病變部位確定評(píng)分系數(shù)：即左主干(LM)病變×5.0；左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)近段病變×2.5；LAD中段病變×1.5；LAD遠(yuǎn)段病變×1.0；對(duì)角支病變：第一對(duì)角支病變×1.0；第二對(duì)角支病變×0.5；左冠狀動(dòng)脈回旋支(LCX)近段病變×2.5；LCX遠(yuǎn)段病變×1.0；后降支病變×1.0；后側(cè)支病變×0.5；右冠狀動(dòng)脈(RCA)近、中、遠(yuǎn)段病變均×1.0。各患者病變累計(jì)積分之和即為其冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度的總積分。

1.4 睡眠質(zhì)量評(píng)估 患者均進(jìn)行阿森斯失眠量表(AIS)及匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)量表(PSQI)評(píng)分。

1.5 血液檢測(cè) 受試者入院后次日清晨空腹采集前臂靜脈血，于宜昌市中心人民醫(yī)院檢驗(yàn)科采用酶法檢測(cè)血糖、血脂、肝腎功能、血肌酐(Scr)、C反應(yīng)蛋白(CRP)及心肌酶。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè) 晝夜節(jié)律基因Bmal1和Clock及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2及MMP9 mRNA表達(dá)采用qRT-PCR檢測(cè)。從采集到的外周抗凝血提取單個(gè)核細(xì)胞，按總RNA提取試劑盒(Lot DP419，TIANGEN Biotech，China)說(shuō)明書(shū)提取總RNA，以提取的總RNA為模板，按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Lot 00422877，Thermo Scientific，USA)說(shuō)明書(shū)以42℃ 60 min，25℃ 5 min，70℃ 5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成的cDNA立即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或在-20℃下儲(chǔ)存。根據(jù)SYBRP?Premix Ex TaqTM Ⅱ (Lot RR820A，Takara，Japan) 說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃ 15 s；60℃ 30 s；72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，然后60℃延伸30 s，循環(huán)結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線(xiàn)。引物序列：GADPH上游引物：5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′；下游引物：5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′；Bmal1上游引物：5′-GAGCAGCTCTCCTCCTCTGA-3′；下游引物：5′-CGTCGTGCTCCAGAACATAA-3′；Clock上游引物：5′-AGAGCACCTTCCCTCAGTCA-3′；下游引物：5′-GCACGTGTGCTACTGTGGTT-3′；MMP2上游引物：5′-ACCTGAAGCTGGAGAACCAA-3′；下游引物：5′-TATCGAAGGCAGTGGAGAGG-3′；MMP9上游引物：5′-CGACGTCTTCCAGTACCGAG-3′；下游引物：5′-TTGTATCCGGCAAACTGGCT-3′。按照上述反應(yīng)體系及反應(yīng)條件完成操作，采用2-ΔΔCt比較量化法對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)，Pearson分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般臨床資料比較 在年齡、BMI、Scr、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、吸煙史、飲酒史、糖尿病和高血壓等指標(biāo)方面，3組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；A3組空腹血糖、CRP、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)明顯高于A1組和A2組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 各組睡眠情況比較 對(duì)于睡眠質(zhì)量AIS評(píng)分和PSQI評(píng)分，A3組明顯高于A2組和A1組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 各組冠狀動(dòng)脈狹窄程度比較 A3組Gensini評(píng)分明顯高于A2組與A1組(P<0.05)，且A2組明顯高于A1組(P<0.05)。 見(jiàn)表1。

表1 各組臨床資料、睡眠質(zhì)量和Gensini評(píng)分比較

與A1組比較：1)P<0.05；與A2組比較：2)P<0.05；表2同

2.4 各組外周血晝夜節(jié)律基因Bmal1和Clock mRNA表達(dá) 晝夜節(jié)律基因Bmal1和Clock mRNA表達(dá)，A1組明顯高于A2組和A3組(P<0.05)，A2組明顯高于A3組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.5 各組外周血MMP2和MMP9 mRNA表達(dá) MMP2和MMP9 mRNA表達(dá)，A3組明顯高于A2組和A1組(P<0.05)，A2組明顯高于A1組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.6 晝夜節(jié)律基因Bmal1和Clock mRNA的表達(dá)水平與Gensini評(píng)分相關(guān)性 Bmal1、Clock mRNA表達(dá)水平均與Gensini評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.708 4、-0.680 4，P<0.000 1)，見(jiàn)圖1。

表2 各組Bmal1、Clock 、MMP2、MMP9 mRNA表達(dá)比較

圖1 女性急性冠脈綜合征患者晝夜節(jié)律基因Bmal1和Clock mRNA的表達(dá)水平與Gensini評(píng)分相關(guān)性

3 討 論

本研究說(shuō)明女性患者睡眠質(zhì)量下降與急性冠脈綜合征的發(fā)生密切相關(guān)。女性晝夜節(jié)律紊亂與急性冠脈綜合征的發(fā)生有關(guān)，并且與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)。

睡眠時(shí)間不足，睡眠質(zhì)量下降可以導(dǎo)致肥胖、糖尿病、高血壓和心腦血管疾病〔6～8〕。Sharma等〔9〕發(fā)現(xiàn)睡眠質(zhì)量差或每天睡眠時(shí)間小于6 h會(huì)增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)外的一些研究也表明當(dāng)睡眠質(zhì)量下降，睡眠時(shí)間縮短時(shí)，會(huì)導(dǎo)致交感神經(jīng)異常興奮，血壓升高，心率變異性降低；內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，血管舒張-收縮功能異常；激素分泌紊亂；炎癥因子(CRP、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等)分泌增多；糖脂代謝紊亂〔10～12〕。而這些都是動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。本研究中也觀察到當(dāng)女性患者睡眠質(zhì)量越差時(shí)，冠脈病變?cè)絿?yán)重。

生物體晝夜節(jié)律的穩(wěn)定主要是由Bmal1和Clock組成的異二聚體來(lái)調(diào)控的。研究發(fā)現(xiàn)小鼠生物鐘基因的改變可以影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成，全Bmal1基因敲除Apoe-/-Ldlr-/-小鼠后給予普通飲食或高脂飲食都會(huì)加快主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，同樣Apoe-/-小鼠骨髓細(xì)胞特異性敲除Clock基因也會(huì)加快動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程〔13〕。將野生型小鼠主動(dòng)脈移植到Bmal1-/-小鼠體內(nèi)將不會(huì)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性病變，而將Bmal1-/-小鼠的主動(dòng)脈移植到野生型小鼠體內(nèi)可以在移植的主動(dòng)脈上發(fā)現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成〔14〕。本研究同樣發(fā)現(xiàn)Bmal1和Clock mRNA表達(dá)在急性冠脈綜合征患者中明顯降低，且與冠脈狹窄程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

MMPs參與了斑塊的形成和血管壁的重塑，在泡沫細(xì)胞豐富的區(qū)域，MMPs的濃度較高，這說(shuō)明MMPs在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs濃度升高會(huì)促進(jìn)斑塊的破裂〔15〕，此外，MMPs活性的增強(qiáng)會(huì)激活促炎因子的表達(dá)〔16〕。Ma等〔17〕發(fā)現(xiàn)在睡眠剝奪可以激活小鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路并且上調(diào)MMPs mRNA和蛋白水平。本研究也發(fā)現(xiàn)相比于冠脈正常女性患者，女性急性冠脈綜合征患者中MMP2和MMP9的表達(dá)明顯升高，與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)。

綜上，現(xiàn)代女性雖然較少有吸煙、高脂飲食等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，但是在工作和家庭的雙重壓力下，易于出現(xiàn)失眠、熬夜、抑郁等導(dǎo)致晝夜節(jié)律紊亂的情況，這些往往得不到重視，導(dǎo)致女性急性冠脈綜合征患者得不到及時(shí)規(guī)范的治療〔18〕。女性患者晝夜節(jié)律紊亂會(huì)導(dǎo)致急性冠脈綜合征的發(fā)生，并且與冠脈病變程度呈正相關(guān)關(guān)系。但是其潛在的作用機(jī)制尚不清楚，通過(guò)對(duì)其影響晝夜節(jié)律紊亂因素的調(diào)控及對(duì)其相關(guān)性針對(duì)治療可以為女性急性冠脈綜合征患者的預(yù)防治療提供新的思路。