代小偉 陳雙雙 楊新宇 趙琰楓 田麗麗 易俊莉 陳昊 丁北川

結(jié)核病病原學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，是確定結(jié)核病診斷和選擇化療方案的重要依據(jù)。世界衛(wèi)生組織[1]在《2018年全球結(jié)核病報告》中指出，2017年全球約有1000萬例新發(fā)結(jié)核病患者，其中有640萬例新發(fā)患者被正式通報給國家有關(guān)部門，估計(jì)數(shù)與報告數(shù)之間的差距，主要是由于病例漏報以及漏診造成的。為減少漏報和漏診，提高細(xì)菌學(xué)檢查陽性率，中華人民共和國國務(wù)院辦公廳[2]發(fā)布了《“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃》，要求肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率要達(dá)到50%以上。本研究采用痰涂片抗酸染色鏡檢(簡稱“涂片法”)、L-J培養(yǎng)基(Lowenstein-Jenden medium)固體培養(yǎng)(簡稱“L-J法”)、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960法”)及GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert法”)等4種方法對疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，比較和評價4種方法單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測的診斷效能。

材料和方法

一、一般資料

本研究選取2018年1月1日至2018年12月31日就診于北京結(jié)核病控制研究所門診的451例疑似肺結(jié)核患者(樣本數(shù)量達(dá)到診斷性試驗(yàn)樣本量的要求)，每例患者留取痰標(biāo)本，同時完成3次涂片法、2次L-J法、1次MGIT 960法和1次GeneXpert法檢測。并對固體或液體培養(yǎng)物用PCR方法進(jìn)行初步菌群鑒定，對非結(jié)核分枝桿菌(NTM)進(jìn)行微陣列基因芯片檢測。

二、儀器和試劑

萋-尼抗酸染色染液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，酸性羅氏培養(yǎng)基由河南賽諾特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，MGIT 960全自動結(jié)核分枝桿菌快速液體培養(yǎng)儀及其配套試劑由美國BD公司生產(chǎn)，GeneXpert MTB/RIF核酸檢測儀及試劑由美國Cepheid公司生產(chǎn)。PCR-熒光探針法檢測使用Roche LightCycler 480儀，試劑由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(微陣列基因芯片法)、核酸提取儀ExtractorTM36、晶芯微陣列芯片掃描儀LuxScan-10K/B、晶芯芯片雜交儀BioMixerTMⅡ、晶芯SlideWasherTM8芯片洗干儀均購自博奧生物有限公司。

三、檢測方法

1.涂片法：采用萋-尼抗酸染色，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4](簡稱“《規(guī)程》”)進(jìn)行痰涂片抗酸染色鏡檢及結(jié)果判讀。同一例3份完成涂片的標(biāo)本中，任何一份發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌即判定為涂片陽性。

2.L-J法：按照《規(guī)程》，將痰液用4%NaOH以1∶1比例進(jìn)行消化處理，15 min后取0.1 ml接種到酸性羅氏培養(yǎng)基中。每周觀察1次培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)菌落生長后挑取菌落完成涂片，菌落經(jīng)抗酸染色鏡檢陽性者報培養(yǎng)陽性；2個月未見菌落生長報告陰性。同一患者2份完成固體培養(yǎng)的標(biāo)本中，任何一份發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌生長即判定為L-J檢測陽性。陽性菌落進(jìn)行抗酸染色鏡檢，確定菌純度，同一份標(biāo)本GeneXpert法檢測陰性而L-J法培養(yǎng)陽性的菌株，進(jìn)行PCR檢測，做初步菌群鑒定。

3.MGIT 960法：嚴(yán)格按照BACTEC MGIT 960系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行操作，吸取0.5 ml痰標(biāo)本加入到50 ml圓底離心管內(nèi)，再加入1～2 ml前處理液(NALC-NaOH)，震蕩消化15 min，加入40 ml 磷酸鹽緩沖液(PBS)中和離心(3000×g離心18 min),棄上清，加1 ml的PBS進(jìn)行重懸沉淀，取0.1 ml接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)管內(nèi)。培養(yǎng)陰性結(jié)果報告時間設(shè)定為滿42 d。儀器報告陽性后，取培養(yǎng)液進(jìn)行抗酸染色鏡檢，確定菌純度，同一份標(biāo)本GeneXpert法檢測陰性而MGIT 960法培養(yǎng)陽性的菌，進(jìn)行PCR檢測，做初步菌群鑒定。

4.GeneXpert法：檢測嚴(yán)格按照說明書操作，取1 ml痰標(biāo)本，加入2 ml標(biāo)本處理液，震蕩混勻，靜置15 min后，吸取2 ml液化標(biāo)本于反應(yīng)盒內(nèi)，將加好標(biāo)本的反應(yīng)試劑盒放到檢測儀內(nèi)，開始自動檢測，反應(yīng)結(jié)束后在檢測系統(tǒng)窗口下直接觀察測試結(jié)果。

5.PCR檢測：對GeneXpert 法檢測陰性，且其他3種方法檢測陽性的患者菌株進(jìn)行PCR熒光探針法檢查，挑取少量菌落入80 μl核酸提取液，充分渦旋后放入核酸提取儀，最大轉(zhuǎn)速震蕩5 min，95 ℃水浴5 min， 離心半徑8.2 cm，5000 r/min 離心1 min；取上清2 μl入擴(kuò)增反應(yīng)液，上機(jī)。樣本擴(kuò)增曲線為S型，Ct值<40判定為陽性。

6.微陣列基因芯片：PCR檢測鑒定為NTM的菌株，進(jìn)行微陣列基因芯片檢測。在核酸提取管中加入50 μl 核酸提取液，挑取單個菌落放入核酸提取儀，最大轉(zhuǎn)速震蕩5 min后95 ℃水浴5 min，5000×g離心1 min；將2 μl提取出來的DNA 加入至18 μl反應(yīng)體系中，按晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增、變性，從蓋片的加樣孔中加入14 μl雜交反應(yīng)物；蓋上雜交盒并密封，將密封好的雜交盒水平放入50 ℃的芯片雜交儀中雜交2 h，記錄芯片的編號、微陣列位置及對應(yīng)的樣本編號；待雜交反應(yīng)結(jié)束后將芯片從雜交盒中取出，用十二烷基硫酸鈉洗液和檸檬酸鈉洗液沖洗干凈，甩干后放入芯片掃描儀，用晶芯結(jié)核分枝桿菌檢測芯片系統(tǒng)判讀芯片結(jié)果。

四、質(zhì)量控制

1.抗酸染色鏡檢質(zhì)量控制：(1)相應(yīng)檢驗(yàn)項(xiàng)目按照《規(guī)程》相關(guān)規(guī)定，完成室間質(zhì)量評估，項(xiàng)目質(zhì)量合格。(2)相應(yīng)檢驗(yàn)項(xiàng)目按照《規(guī)程》相關(guān)規(guī)定，建立并嚴(yán)格執(zhí)行室內(nèi)質(zhì)量保障體系相關(guān)規(guī)定。

2.痰培養(yǎng)質(zhì)量控制：(1)固體培養(yǎng)質(zhì)量控制。每批培養(yǎng)基進(jìn)行無菌性測試和敏感性測試；培養(yǎng)基在冷藏條件下不超過2個月。(2)液體培養(yǎng)質(zhì)量控制。每月打印質(zhì)量控制報告；每批MGIT培養(yǎng)管進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量控制檢測(使用結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌液制備)。

3.GeneXpert法質(zhì)量控制：每個檢測匣定期進(jìn)行樣品處理質(zhì)量控制(SPC)和探針質(zhì)量控制(PCC)，以確保樣品經(jīng)過正確處理和探針符合指定的接受標(biāo)準(zhǔn)，保證檢測系統(tǒng)合格。

4.PCR質(zhì)量控制：檢測中同時提取試劑盒內(nèi)提供的陽性對照和陰性對照液體的DNA，并與樣品同時檢測，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5.微陣列基因芯片質(zhì)量控制：檢測中同時擴(kuò)增試劑盒內(nèi)提供的陽性對照和陰性對照DNA，與樣品同時檢測，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有檢測項(xiàng)目結(jié)果、患者基本信息及患者臨床診斷結(jié)果，采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床診斷結(jié)果

451例疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本性狀分布：889份為黏液痰，12份為干酪痰，37份為血痰，415份為唾液，合格痰標(biāo)本占69.3%(938/1353)，不合格標(biāo)本占30.7%(415/1353)。根據(jù)臨床癥狀、胸片及實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目結(jié)果，按照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行診斷。451例可疑肺結(jié)核患者中，臨床最終診斷為肺結(jié)核患者227例(肺結(jié)核225例、肺結(jié)核并發(fā)結(jié)核性胸膜炎2例)，非肺結(jié)核患者224例(NTM肺病11例，陳舊性肺結(jié)核6例，肺部陰影待查181例，胸腔積液3例，肺纖維化1例，肺炎3例，肺癌1例，密切接觸者篩查18例)。其中NTM肺病患者先經(jīng)過PCR檢測確定為NTM，再取患者2次培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行微陣列基因芯片檢測，2次檢測結(jié)果為同一種NTM者，最終診斷為NTM肺病。

二、各方法單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測的診斷效能比較

1.本研究4種方法單獨(dú)檢測的診斷效能比較：以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)判斷4種方法單獨(dú)檢測的診斷效能結(jié)果見表1。從表1可以看出，4種檢測方法的敏感度與一致率從高到低的排位順序?yàn)镸GIT 960法、GeneXpert法、L-J法、涂片法。

對4種檢測方法的診斷敏感度進(jìn)行檢驗(yàn)，L-J法檢出率高于涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=232.612,P<0.01)；GeneXpert法檢出率高于L-J法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=211.335，P<0.01)；MGIT 960法檢出率明顯高于GeneXpert法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=213.736，P<0.01)。4種方法與臨床診斷的一致率均在59.0%～69.0%之間。

2.本研究4種方法檢測后聯(lián)合判斷的診斷效能比較：對3組聯(lián)合檢測方式的診斷敏感度進(jìn)行檢驗(yàn)，3種方法聯(lián)用的檢測敏感度高于2種方法聯(lián)用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=155.807,P<0.01)；4種方法聯(lián)用的檢測敏感度高于3種方法聯(lián)用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=176.173，P<0.01)，4種方法聯(lián)用的檢測敏感度最高，與臨床診斷的一致率較4種方法單獨(dú)檢測高10%左右(表2)。

表1 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)判斷4種方法單獨(dú)檢測的診斷效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/樣本總例數(shù)

表2 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)判斷4種方法檢測后聯(lián)合判斷的診斷效能

注2種方法聯(lián)用：涂片法和L-J法聯(lián)用；3種方法聯(lián)用：涂片法、 L-J法 和GeneXpert法；4種方法聯(lián)用：涂片法、L-J法、GeneXpert法和MGIT 960法聯(lián)用。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/樣本總例數(shù)

3.涂陰疑似肺結(jié)核患者中L-J法、GeneXpert 法以及MGIT 960法的檢出情況：227例肺結(jié)核患者中，涂片法檢測陰性為176例。涂陰的標(biāo)本中，用L-J法檢出陽性28例，陽性檢出率為15.9%；用GeneXpert法檢出陽性40例，陽性檢出率為22.7%；用MGIT 960法檢出陽性52例，陽性檢出率為29.5%。GeneXpert法與L-J法對涂陰結(jié)核病的陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=44.599，P<0.01)；MGIT 960法與GeneXpert法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.693，P<0.01)。

討 論

2017年11月9日，中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會頒布了《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》。將分枝桿菌核酸檢測和液體培養(yǎng)均納入了結(jié)核病病原學(xué)檢查范疇[5]。本研究選取門診疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，進(jìn)行涂片法、L-J法、MGIT 960法和GeneXpert等4種病原學(xué)方法檢測。涂片法簡單快捷，成本低易普及，目前仍是國內(nèi)最主要的患者發(fā)現(xiàn)方法和隨訪時療效的監(jiān)測手段[6-7]。但涂片法陽性檢出率低，在本組結(jié)核病患者中檢測敏感度為22.5%(51/227)，難以滿足臨床診斷的需求。從結(jié)核病控制、流行病學(xué)調(diào)查研究和臨床診斷與治療的角度看，分枝桿菌的分離培養(yǎng)是結(jié)核病病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]。但結(jié)核分枝桿菌生長緩慢耗時長，需5～8周時間，明顯滯后于臨床醫(yī)師對肺結(jié)核早期診斷的期望[9]。

2010年WHO即推薦使用GeneXpert MTB/RIF分子診斷技術(shù)，其基于半巢式定量PCR擴(kuò)增過程，在一個封閉的試劑盒中自動完成，可在2 h內(nèi)完成檢出結(jié)核分枝桿菌的同時，可檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥基因是否發(fā)生突變[10]，進(jìn)而為判斷是否存在利福平耐藥提供參考依據(jù)；該檢測方法對結(jié)核病的診治具有里程碑式的意義[11]。本研究中GeneXpert法檢測的敏感度明顯高于涂片法和L-J法，與趙冰等[12]、周喜桃等[13]的研究結(jié)果一致，并以該檢測方法具有快速、簡單、敏感度高、對生物安全要求不高且能同時檢測對利福平的耐藥情況等優(yōu)點(diǎn)，推薦其在基層實(shí)驗(yàn)室使用和推廣。1977年美國BD公司研制出基于液體培養(yǎng)的BACTEC分枝桿菌全自動檢測系統(tǒng)。與固體培養(yǎng)相比，目前的MGIT 960系統(tǒng),在操作步驟上除了去污染試劑相對“溫和”且更高效外，還調(diào)整采用了中和離心集菌等接種前的處理步驟，明顯提高了分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性率；同時由于在專用7H9培養(yǎng)管中加入含有Ruthenium的熒光底物，當(dāng)細(xì)菌生長時，通過細(xì)菌代謝監(jiān)測底物激發(fā)產(chǎn)生熒光，也縮短了陽性結(jié)果的判定時間。本研究中，MGIT 960法檢測的敏感度最高達(dá)43.2%，與Zhao等[14]的研究結(jié)果相符。4種檢測方法中，GeneXpert法和MGIT 960法的敏感度明顯高于傳統(tǒng)的涂片法和L-J法。

目前，大部分基層醫(yī)院以傳統(tǒng)抗酸染色鏡檢為結(jié)核病患者的主要發(fā)現(xiàn)手段，陽性率僅在25%左右，仍有75%的涂陰肺結(jié)核疑似患者面臨診斷問題[15]。本研究總結(jié)了涂陰結(jié)核病患者分別用L-J法、GeneXpert法和MGIT 960法檢測后，陽性檢出率均有不同程度的提高，其中L-J法和MGIT 960法對涂陰肺結(jié)核的檢出率與張娟等[16]的研究結(jié)果相近，較郭新枝等[17]的研究結(jié)果低近1倍，分析原因可能與痰標(biāo)本的質(zhì)量有關(guān)系。楊新宇等[3]研究顯示，痰標(biāo)本的質(zhì)量與檢測陽性率有著密切的關(guān)系；郭新枝等[17]的研究中，研究對象均為住院患者，其在醫(yī)護(hù)人員指導(dǎo)和監(jiān)視下留痰的質(zhì)量比較高；而本研究的研究對象均為門診患者，痰標(biāo)本質(zhì)量不易控制，其中不合格標(biāo)本占30.7%。

為掌握結(jié)核病臨床診斷病原學(xué)依據(jù)，滿足結(jié)核病防治工作的要求，已有很多報告嘗試和研究將不同檢測方法進(jìn)行聯(lián)合檢測[18-21]。根據(jù)《“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃》要求，肺結(jié)核患者病原學(xué)檢測陽性率要達(dá)到50%以上。按照北京市各區(qū)(縣)結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，本研究將病原學(xué)檢測方法進(jìn)行3種組合，并比較其診斷效能。傳統(tǒng)涂片法和L-J法聯(lián)合應(yīng)用時，陽性率為34.8%,檢出效率不如單獨(dú)應(yīng)用GeneXpert法或MGIT 960法高；將GeneXpert法與涂片法和L-J法聯(lián)合應(yīng)用時，病原學(xué)陽性率提高到43.6%；而將涂片法、L-J法、GeneXpert法和MGIT 960法聯(lián)合應(yīng)用時，病原學(xué)陽性率可達(dá)到49.8%；如果加強(qiáng)對結(jié)核病患者進(jìn)行宣傳教育，引導(dǎo)其正確地留取高質(zhì)量痰液標(biāo)本，必然能達(dá)到國家《“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃》關(guān)于病原學(xué)檢測陽性率達(dá)到50%以上的要求。雖然液體培養(yǎng)儀器和實(shí)驗(yàn)操作步驟略復(fù)雜，前處理有集菌過程，對實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求都比較高，但鑒于MGIT 960法對病原學(xué)陽性率的貢獻(xiàn)，以及其培養(yǎng)時間較短、陽性培養(yǎng)物可后續(xù)進(jìn)行分子及表型藥物敏感性試驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)，仍應(yīng)鼓勵有條件的區(qū)(縣)結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室積極開展液體培養(yǎng)。

本研究結(jié)果顯示，以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，MGIT 960法檢測的敏感度、一致率最高，GeneXpert法特異度最高。有研究主張用GeneXpert、離心濃縮涂片法及MGIT 960法取代傳統(tǒng)的涂片及培養(yǎng)[22]，筆者認(rèn)為在不同條件的檢測實(shí)驗(yàn)室，各種檢測方法均占有重要的地位，檢測中不能互相代替。為更好地服務(wù)患者、服務(wù)臨床，以及提高病原學(xué)陽性率、減少漏診，建議將上述4種病原學(xué)檢測方法聯(lián)合應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)各種檢測方法診斷效能的最大化。