孫逸敏 王振清 賈佳 谷化平

早期診斷和及時(shí)治療在結(jié)核病防治中起關(guān)鍵作用，而提高診斷技術(shù)的檢出率是早期發(fā)現(xiàn)患者的核心[1]。分枝桿菌涂片鏡檢作為最早的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查手段，目前仍是結(jié)核病檢驗(yàn)方法學(xué)的基礎(chǔ)，具有快速、方便、價(jià)廉的優(yōu)勢(shì)，對(duì)判斷患者的傳染性具有重要意義，但其陽(yáng)性檢出率較低[2]。液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)(thinprep cytologic test，TCT)是一種將脫落細(xì)胞保存在液體中，通過機(jī)械、氣動(dòng)與流體力學(xué)原理，采用全自動(dòng)設(shè)備將脫落細(xì)胞均勻分散地貼附于載玻片上的最優(yōu)質(zhì)、惟一獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證的薄層制片技術(shù)，可大大減少阻礙視線的血液、黏液和炎細(xì)胞的數(shù)量，主要應(yīng)用于宮頸、體腔積液、尿液、肛管直腸脫落細(xì)胞的檢查[1]，對(duì)提高癌前病變檢出率有重要意義；但目前用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的報(bào)道較少[1]。筆者采用TCT檢測(cè)初診為疑似肺結(jié)核患者的不同類型標(biāo)本(包括痰液、胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本)中分枝桿菌的陽(yáng)性檢出率及檢測(cè)效能，為TCT的應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

材料和方法

一、研究對(duì)象

搜集2017年11月至2019年2月河北省張家口市傳染病醫(yī)院診治的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的248例初診為疑似肺結(jié)核的患者。其中男133例(53.63%)，女115例(46.37%)；年齡12～85歲，平均(43.52±19.73)歲。由結(jié)核科醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)臨床表現(xiàn)及體征按照每例患者選用1種類型臨床標(biāo)本的原則共采集248份臨床標(biāo)本，包括101份晨痰標(biāo)本(具有咳嗽、咳痰≥2周等呼吸道癥狀，或痰中帶血或咯血)、67份胸腔積液標(biāo)本(胸部CT平掃檢查提示肺內(nèi)浸潤(rùn)性病變伴胸腔積液)、80份支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本(不明原因慢性持續(xù)性咳嗽、咳痰、喘鳴、聲嘶及呼喚困難，痰標(biāo)本抗酸桿菌陽(yáng)性而肺部CT平掃未發(fā)現(xiàn)結(jié)核病灶)。最終通過臨床綜合診斷確診為肺結(jié)核患者181例，非肺結(jié)核患者67例[包括肺炎43例、慢性阻塞性肺疾病(COPD)7例、支氣管擴(kuò)張8例、肺癌7例、未明確病因2例]。

所有入選患者均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；均行胸部CT平掃檢查，提示肺內(nèi)浸潤(rùn)性病變，考慮肺結(jié)核可能性大；均符合《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)患者臨床癥狀、體征、X線攝影檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、臨床試驗(yàn)性抗結(jié)核藥物治療等臨床綜合診斷確診；均未進(jìn)行隨訪和使用抗結(jié)核藥物治療。

二、 檢測(cè)技術(shù)與方法

對(duì)臨床送檢的每份痰液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行萋-尼抗酸染色涂片法鏡檢(Ziehl-Neelsen 染色涂片法鏡檢，簡(jiǎn)稱“Z-N涂片法”)、TCT和BACTECTMMGIT 960分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960法”)檢測(cè)。

1.Z-N涂片法：(1)痰標(biāo)本直接按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]行Z-N染色涂片鏡檢(油鏡 ×100)，可見細(xì)胞重疊，厚薄不均，紅色為抗酸桿菌，藍(lán)色為細(xì)胞碎片及黏液、纖維蛋白成分，染色結(jié)構(gòu)模糊，整個(gè)視野僅偶見1小束分枝桿菌，記錄鏡檢結(jié)果；(2)胸腔積液和支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本首先靜置2～4 h，再取20～50 ml沉淀物經(jīng)3000×g離心20～30 min后，取離心后沉淀物1 ml參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行涂片、Z-N抗酸染色、鏡檢，記錄結(jié)果。

2.TCT：(1)于生物安全柜中將痰標(biāo)本加入至專用細(xì)胞保存液中靜置15 min，若黏液較多則在痰標(biāo)本中加入2～3 ml痰消化液(NALC-NaOH混合液，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；處理(具體方法依據(jù)珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供的使用說明書)后震蕩3 min進(jìn)行液化，3000×g離心 5 min，棄上清液，取1 ml濃縮樣本加入制片夾中，置于配套制片機(jī)內(nèi)1500×g離心2 min；采用95%乙醇固定15 min后制片，再烘干玻片、Z-N抗酸染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，鏡檢(油鏡 ×100)可見背景清晰干凈，細(xì)菌均勻分布在載玻片上，且形態(tài)和結(jié)構(gòu)保存良好，涂片未見血液、黏稠膿液、纖維蛋白成分，標(biāo)本整個(gè)視野均是染色為紅色的分枝桿菌，記錄結(jié)果；(2)胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液均取50 ml送檢標(biāo)本，3000×g離心5 min，棄上清液，如有黏液加入等量NALC-NaOH消化液，取1 ml濃縮樣本加入專用制片夾，余下制片步驟同痰標(biāo)本，上鏡觀察，記錄結(jié)果。

3. MGIT 960法：248份標(biāo)本均按照MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌液基檢測(cè)系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)BD公司)說明書的規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算Z-N涂片法、TCT、MGIT 960法的檢測(cè)效能。3種檢測(cè)方法計(jì)數(shù)資料間的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

結(jié) 果

一、3種方法檢測(cè)不同類型標(biāo)本中分枝桿菌陽(yáng)性率的比較

248份痰培養(yǎng)標(biāo)本中，MGIT 960法檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本為155份，包括晨痰82份、胸腔積液17份、支氣管肺泡灌洗液56份。TCT檢測(cè)總標(biāo)本、痰液標(biāo)本、胸腔積液標(biāo)本、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中分枝桿菌的陽(yáng)性率(分別為53.63%、67.33%、17.91%、66.25%)均明顯高于Z-N染色法(分別為25.81%、36.63%、7.46%、27.50%)(χ2=46.788，P=0.000；χ2=19.736，P=0.000；χ2=9.449，P=0.002；χ2=20.833，P=0.000)。但TCT檢測(cè)痰標(biāo)本的陽(yáng)性率明顯低于MGIT 960法，而胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果相比較與MGIT 960法差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表1。

二、 TCT和Z-N染色法檢測(cè)不同類型培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中分枝桿菌陽(yáng)性率的情況

TCT檢測(cè)培養(yǎng)陽(yáng)性的痰液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中分枝桿菌的陽(yáng)性率明顯高于Z-N染色法(P值均<0.05)，詳見表2。

三、3種方法對(duì)不同類型臨床標(biāo)本的檢測(cè)效能

以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，TCT檢測(cè)所有臨床標(biāo)本的敏感度[72.93%(132/181)]和一致率[79.84%(198/248)]均明顯高于Z-N染色法[分別為30.39%(55/181)、48.79%(121/248)]，但明顯低于MGIT 960法[分別為85.64%(155/181)、89.52%(222/248)]。三者特異度接近[分別為98.51%(66/67)、98.51%(66/67)、100.00%(67/67)]，詳見表3。

表1 不同類型標(biāo)本采用3種方法檢測(cè)的分枝桿菌陽(yáng)性率比較

注括號(hào)外數(shù)值為“標(biāo)本份數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”；a：為TCT與MGIT 960法檢測(cè)陽(yáng)性率的比較；b：為Z-N染色法與MGIT 960法檢測(cè)陽(yáng)性率的比較

表2 不同類型培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本采用TCT和Z-N染色法檢測(cè)的分枝桿菌陽(yáng)性率比較

注括號(hào)外數(shù)值為“標(biāo)本份數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”

表3 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)3種方法的檢測(cè)效能

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

討 論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的全身多系統(tǒng)疾病，以肺結(jié)核多見[5]，是嚴(yán)重危害人類健康的全球性呼吸系統(tǒng)傳染病[6]。早期準(zhǔn)確診斷是結(jié)核病患者得以及時(shí)治療的關(guān)鍵，而提高診斷技術(shù)對(duì)早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者至關(guān)重要。我國(guó)基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)著主要的肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)工作，但對(duì)肺結(jié)核患者的檢測(cè)手段極其有限，盡管結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)仍是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]，敏感度較高，但獲得結(jié)果的時(shí)間較長(zhǎng)(2～6周)[8]，不利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療患者[9]。因此，基于傳統(tǒng)涂片法(標(biāo)本涂片染色后顯微鏡下形態(tài)學(xué)檢查)簡(jiǎn)單、快速、成本低的優(yōu)勢(shì)[10]，目前仍是基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的結(jié)核病診斷技術(shù)[11-13]。但由于傳統(tǒng)涂片法是手工將體液沉淀物推涂在玻片上，厚薄不一，難以去除細(xì)胞碎片、血液、黏液等成分，導(dǎo)致視野模糊不清，且當(dāng)分枝桿菌菌量偏少時(shí)也難以通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其敏感度和特異度不高[8]；加之涂片技術(shù)存在盲目取材、標(biāo)本利用率不高，涂片過大、過厚，存在大量的紅細(xì)胞、黏液，導(dǎo)致觀察者視覺疲勞，干擾診斷。為提高傳統(tǒng)涂片法的敏感度，研究者不斷對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化[14]。

TCT是近年來應(yīng)用于臨床細(xì)胞病理學(xué)診斷的一種新技術(shù)，其優(yōu)于傳統(tǒng)涂片法的特點(diǎn)如下：(1)具有標(biāo)本保存功能。采用專用細(xì)胞保存液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行解黏、消化處理，可保證標(biāo)本新鮮完好，且去除了標(biāo)本中的黏液、細(xì)胞碎片、纖維蛋白、膿液等的干擾，使背景清晰干凈，細(xì)胞及細(xì)菌均勻分布在載玻片上，且形態(tài)和結(jié)構(gòu)保存良好；(2)標(biāo)本利用率高。該技術(shù)對(duì)保存在液基瓶?jī)?nèi)的標(biāo)本可以制作多張涂片，符合不丟棄任何所選材料的原則[12]。對(duì)同一標(biāo)本也可以進(jìn)行多項(xiàng)檢查，如目前廣泛應(yīng)用的細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞免疫化學(xué)、以及分子生物學(xué)檢測(cè)等，可以滿足臨床診斷需要，是TCT的顯著特點(diǎn)；(3)涂片技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)。由于無人為的涂抹、牽拉、擠壓，且通過配套制片機(jī)甩片，涂片無血液、黏稠膿液、纖維蛋白成分，可將細(xì)胞、細(xì)菌均勻地分布在載玻片上，無重疊、損傷、變形；并因除去了標(biāo)本中的黏液、細(xì)胞碎片、纖維蛋白、膿液等的干擾，使背景清晰干凈，易于觀察鑒別，可最大限度提取標(biāo)本制片，增加細(xì)菌呈現(xiàn)量[11]，在保證原有染色性能的基礎(chǔ)上，明顯提高了涂片質(zhì)量、陽(yáng)性檢出率和診斷能力；(4)涂片標(biāo)準(zhǔn)化。TCT可使分枝桿菌染色涂片達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，降低了因在涂片和染色過程中不按程序規(guī)范操作導(dǎo)致的結(jié)果差異，可作為滿足室內(nèi)及室間質(zhì)量控制的需要和患者診斷回顧性分析的依據(jù)[13]。但值得注意是，TCT在檢測(cè)痰標(biāo)本時(shí)，需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理、離心沉淀、專用制片機(jī)甩片，致其成本支出增高、檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)于痰標(biāo)本檢測(cè)量大的實(shí)驗(yàn)室，可能會(huì)影響閱片效率和檢驗(yàn)費(fèi)用，需綜合考慮其應(yīng)用價(jià)值；但對(duì)于胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本則不存在這些問題，其操作仍較傳統(tǒng)方法簡(jiǎn)便、快速，陽(yáng)性檢出率高，有利于臨床快速準(zhǔn)確診斷。

本研究結(jié)果顯示，TCT無論用于所有疑似肺結(jié)核標(biāo)本還是分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本，其檢測(cè)痰液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的陽(yáng)性率均明顯高于Z-N染色法，尤其可明顯提高涂片抗酸染色“++”以下標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率，且檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的陽(yáng)性率更為明顯。由于涂陰肺結(jié)核患者常少痰甚至無痰，不合格的痰標(biāo)本可明顯影響其檢測(cè)結(jié)果，而支氣管肺泡灌洗液直接取材于病變部位，加之纖維支氣管鏡檢查的“激惹”作用和沖洗，可明顯增加獲得分枝桿菌的機(jī)會(huì)，因此對(duì)于痰菌含量少(無痰或少痰)或菌陰者、肺部病灶局限、與引流支氣管不相通、肺結(jié)核病灶暫時(shí)穩(wěn)定的患者，可采集支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)[15-17]。

本研究以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用TCT、Z-N染色法、MGIT 960法三種方法檢測(cè)不同類型臨床標(biāo)本中的分枝桿菌，TCT檢測(cè)的敏感度、一致率明顯高于Z-N染色法，但低于MGIT 960法，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果相似[2]。進(jìn)一步說明盡管目前Z-N染色法仍是基層醫(yī)院發(fā)現(xiàn)分枝桿菌的重要手段，但直接涂片法的標(biāo)本質(zhì)量差，直接影響到涂片的制片、染色效果，從而降低分枝桿菌的陽(yáng)性檢出率和敏感度[18]；而TCT可以有效減少操作人員的操作誤差，實(shí)現(xiàn)涂片的標(biāo)準(zhǔn)化和最大化有效利用標(biāo)本，特別是對(duì)于荷菌量少的標(biāo)本，可明顯提高分枝桿菌的陽(yáng)性檢出率和敏感度，且陽(yáng)性率與MGIT 960法相當(dāng)。

近年來，一些新的技術(shù)如分子生物學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用于病理學(xué)診斷[19]，如通過檢測(cè)病理標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其DNA來進(jìn)行結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病的鑒別，或通過檢測(cè)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的抗原或抗體進(jìn)行診斷等[20-21]。這些技術(shù)在一定程度上提高了結(jié)核病病理學(xué)診斷的準(zhǔn)確率，為病理學(xué)的發(fā)展提供了新方向，但由于分子生物學(xué)技術(shù)費(fèi)用較高，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及工作人員水平要求也高，在基層醫(yī)院難以開展[22]。而TCT從標(biāo)本收集、保存、制片、診斷等方面均較傳統(tǒng)涂片法有了重大改進(jìn)和提高，尤其在檢測(cè)不同類型體液標(biāo)本時(shí)，其操作簡(jiǎn)單、快速，陽(yáng)性率高，易于臨床推廣，更適用于基層單位，對(duì)肺結(jié)核快速準(zhǔn)確診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。