王文旭　郁飛

摘要：為進(jìn)一步研究目的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位，構(gòu)建融合了紅色熒光蛋白mCherry或mScarlet的表達(dá)載體。選取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61等4個定位基因來構(gòu)建紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體。根據(jù)TAIR數(shù)據(jù)庫中相關(guān)蛋白質(zhì)的基因序列設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增序列并將其分別連接到已制備好的紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體上，制備得到質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化入原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時表達(dá)。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4個紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體，并且成功在擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)。

關(guān)鍵詞：紅色熒光蛋白;融合表達(dá)載體;亞細(xì)胞定位;瞬時表達(dá)

中圖分類號： Q943.2;S188+.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0052-04

熒光蛋白作為一種分子標(biāo)簽，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位以及動態(tài)示蹤等方面有著廣泛的應(yīng)用。相較于其他分子標(biāo)記，熒光蛋白更加易于和目的蛋白融合，對活細(xì)胞毒性小，應(yīng)用更加便利。綠色熒光蛋白（GFP）是最早被發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白，由日本著名化學(xué)家、海洋生物學(xué)家下村修從維多利亞水母中首次發(fā)現(xiàn)[1]。GFP通過一系列體外分子進(jìn)化，發(fā)展出了多種熒光波長不同、發(fā)光強(qiáng)度更高的熒光蛋白，如EGFP（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）、BFP（藍(lán)色熒光蛋白）、CFP（青色熒光蛋白）等[2]。這些熒光蛋白極大地豐富了相應(yīng)的試驗體系和技術(shù)，但由于這些熒光蛋白的發(fā)射波長均在440～529 nm[3]，容易激發(fā)胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生熒光，導(dǎo)致成像時背景較高，限制了這些熒光蛋白的應(yīng)用。

1999年Matz等報道了第一個紅色熒光蛋白DsRed（drFP583）[4]。DsRed自香菇珊瑚中分離得到，具有激發(fā)和發(fā)射波長較長、細(xì)胞內(nèi)成像背景較低等優(yōu)點，但在實際應(yīng)用時常會以二聚體或四聚體形式出現(xiàn)，對組織、器官和細(xì)胞有一定的毒性，且在空間上限制了一些蛋白質(zhì)的功能，從而影響了對目的蛋白的標(biāo)記[5-7]。為解決DsRed的上述缺陷，在隨后的研究過程中，Bevis等應(yīng)用多種體外分子進(jìn)化的手段，對DsRed進(jìn)行了一系列的改造，最終得到了穩(wěn)定地以單體形式存在的紅色熒光蛋白mRFP[8-9]。mRFP有波長較長、半成熟時間較短、不易聚合等一系列優(yōu)點，大大拓展了紅色熒光蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域。Shaner等在mRFP的基礎(chǔ)上，對其發(fā)色基團(tuán)附近的位點進(jìn)行突變，經(jīng)過多輪突變、篩選、加帽加尾等過程得到了mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry及mCherry等一系列波長不同的單體紅色熒光蛋白[10]。2017年，Bindels等以mCherry為模板，經(jīng)過多輪突變改造得到了一個新的熒光蛋白mScarlet。這一新的單體紅色熒光蛋白在發(fā)光強(qiáng)度、波長、熒光壽命等方面均有更優(yōu)的性能[11]。

本研究擬通過構(gòu)建熒光蛋白融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體過表達(dá)的方式，運(yùn)用激光共聚焦顯微技術(shù)來進(jìn)行目的蛋白的胞內(nèi)定位研究。筆者選用pUC18HE-mCherry和pUC18HE-mScarlet NT 2個不同的紅色熒光蛋白表達(dá)載體，選取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61[12]作為定位基因，來構(gòu)建4個紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體。將構(gòu)建好的紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中過表達(dá)，之后觀察細(xì)胞中融合紅色熒光表達(dá)蛋白的定位情況。

1材料與方法

1.1試驗時間與地點

試驗于2017年5—8月在西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郁飛實驗室進(jìn)行。

1.2材料

1.2.1植株、細(xì)菌和載體野生型擬南芥植株（Col-0），由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院賈敏博士提供;大腸桿菌TOPl0、紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體pUC18HE-mCherry和pUC18-mScarlet NT，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分子遺傳實驗室保存。

1.2.2主要工具酶與試劑限制性內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）等均購自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher科技（中國）有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司;金牌超量無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.13種紅色熒光蛋白的同源性比對

在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）數(shù)據(jù)庫中搜索出mRFP、 mCherry和mScarlet的DNA序列。將這3條DNA序列以Fasta格式輸入至NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORFfinder，翻譯為蛋白序列。將mRFP、mCherry和mScarlet的蛋白序列以Fasta格式輸入EMBL數(shù)據(jù)庫的程序Clustal Omega，之后再使用ExPasy上的Box Shade工具修飾所得數(shù)據(jù)，得到序列對比結(jié)果。對比結(jié)果中黑色部分代表這3個蛋白一級結(jié)構(gòu)的相應(yīng)位置上完全相同的氨基酸殘基，灰色部分代表部分相同的氨基酸殘基，consensus中星號（*）對應(yīng)完全相同的氨基酸殘基序列，點號（.）對應(yīng)部分相同的氨基酸殘基序列。

1.3.2融合表達(dá)載體的選取和構(gòu)建選取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61 4個定位基因來構(gòu)建紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體。根據(jù)TAIR網(wǎng)站公布的擬南芥VTI12基因和RabD2a基因的序列設(shè)計引物擴(kuò)增這2個基因的CDS（蛋白質(zhì)編碼區(qū)）序列，引物序列如表1所示。

表1中引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。以野生型擬南芥cDNA為模板，分別用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收后與融合紅色熒光蛋白表達(dá)載體pUC18HE-mCherry分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切時在載體中加入1 μL CIAP（牛小腸堿性磷酸酶，用于防止載體自連）;ARA7以及SYP61在筆者所在實驗室前期工作中已經(jīng)合成，故直接與表達(dá)載體pUC18-mScarlet NT分別用 BamHⅠ 和XhoⅠ雙酶切即可。將酶切后的片段與載體用T4 DNA連接酶于22 ℃恒溫器中反應(yīng)2 h，將得到的連接產(chǎn)物與大腸桿菌TOPl0進(jìn)行轉(zhuǎn)化后涂布于抗性LB培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，利用堿性裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，將連接正確的質(zhì)粒送至華大基因生物科技（深圳）有限公司進(jìn)行序列測定。測定序列無誤后，用金牌無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，以獲得較高濃度的質(zhì)粒（>1 mg/μL）。將得到的質(zhì)粒保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。

1.3.3原生質(zhì)體的制備與瞬時轉(zhuǎn)化

首先配制酶解液：向酶解緩沖液中加入1% 纖維素酶R10和0.2%果膠酶R10，然后將酶解液于55 ℃水浴10 min，以促進(jìn)纖維素酶和離析酶的溶解并且抑制蛋白酶的活性;待水浴后溶液冷卻至室溫，加入1%的1 mol/L CaCl2溶液、0.035%的β-巰基乙醇和0.1%的BSA（牛血清白蛋白）。將配制好的酶解液用0.45 μm濾膜過濾以除去溶液中的雜質(zhì)。用鋒利的小剪刀剪取3～4周齡的野生型擬南芥葉片，保留較長的葉柄，且選取平展嫩綠的葉片。將葉片用清水輕柔沖洗干凈后用鋒利的刀片切成約 1 mm 寬的細(xì)條，然后將切好的葉片浸沒在適量酶解液中。于真空干燥罐中抽氣30 min，使酶解液充分浸潤葉片。隨后在黑暗環(huán)境中 40 r/min 水平搖晃酶解混合液90 min，90 r/min水平搖晃 1 min 以釋放酶解產(chǎn)生的球狀原生質(zhì)體，此時酶解液呈綠色。向酶解液中加入10 mL W5溶液（含154 mmol/L NaCl 9.0 g，125 mmol/L CaCl2 18.38 g，5 mmol/L KCl 0.372 g，2 mmol/L MES 0.42 g，用H2O定容至1 L。用 1 mol/L KOH調(diào)pH值至5.7，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃冷藏保存），輕柔搖晃后用35～75 μm的尼龍膜將酶解液過濾到圓底離心管中。4 ℃低溫300 r/min水平離心5 min，除去上層清液后用10 mL冰預(yù)冷的W5溶液輕柔重懸管底細(xì)胞。如此再次重懸細(xì)胞1次后將混合液冰浴40 min。冰浴時可吸取少量細(xì)胞鏡檢，檢查原生質(zhì)體是否健康完整。冰浴后將細(xì)胞懸浮液于4 ℃低溫 300 r/min 水平離心5 min，用適量MMg溶液（含0.4 mol/L甘露醇72.86 g，15 mmol/L MgCl2 3.05 g，4 mmol/L MES[2-（N-嗎啡啉）乙磺酸]0.58 g，用H2O定容至1 L。用1 mol/L KOH調(diào)pH值至5.7，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃冷藏保存）重懸細(xì)胞。吸取200 μL懸浮液于 2 mL 離心管中，加入約30 μL（質(zhì)粒濃度1 μg/μL）已制備好的質(zhì)粒和230 μL的40% PEG（聚乙二醇）溶液，輕柔混勻后室溫孵育25 min。之后加入800 μL W5溶液，輕柔混勻后于4 ℃低溫 500 r/min 水平離心5 min，除去上層PEG混合液。加入1 mL W5溶液重懸細(xì)胞于6孔板中，置于22 ℃恒溫培養(yǎng)基中 40 r/min 水平搖床上黑暗孵育8～16 h。孵育之后在激光共聚焦顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)。

2結(jié)果與分析

2.13種紅色熒光蛋白的同源性比對及空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

由蛋白序列比對的結(jié)果（圖1）可以看出mRFP、mCherry和mScarlet 3種紅色熒光蛋白序列的分子體外進(jìn)化過程，以及在體外分子進(jìn)化的過程中，由mRFP到mCherry以及到mScarlet所進(jìn)行的加帽、加尾和點突變等改造。

2.2融合表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果與酶切

在TAIR網(wǎng)站查找獲得擬南芥VTI12基因和RabD2a基因的cDNA序列，以野生型擬南芥Col-0 cDNA為模板，用帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物，分別擴(kuò)增出與預(yù)期669 bp大小吻合的條帶以及與預(yù)期612 bp大小吻合的條帶（圖2）。

回收目的條帶并將目的片段與融合紅色熒光蛋白表達(dá)載體pUC18HE-mCherry均用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切后產(chǎn)生約669 bp大小的VTI12的目的條帶、約612 bp大小的RabD2a的目的條帶以及4.7 kb大小的載體條帶（圖3），回收酶切片段。

將筆者所在實驗室前期工作中已經(jīng)合成的ARA7以及SYP61與融合紅色熒光蛋白表達(dá)載體pUC18-mScarlet NT均用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切后產(chǎn)生約603 bp大小的ARA7的目的條帶、約738 bp大小的SYP61的目的條帶以及4.5 kb大小的載體條帶（圖4），回收酶切片段。

2.2.2紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體的鑒定

將帶黏性末端的目的片段與載體相連，取陽性克隆提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗證（圖5），酶切驗證正確無誤后進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4個紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒基因結(jié)構(gòu)如圖6及圖7所示。

2.3原生質(zhì)體細(xì)胞瞬時表達(dá)紅色熒光蛋白的結(jié)果

將上述構(gòu)建好的4個紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)化入已制備好的擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中進(jìn)行過表達(dá)，之后[CM（25]進(jìn)行共聚焦照相，得到的結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，[CM（26]pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61均可在原生質(zhì)體葉肉細(xì)胞中很好地表達(dá)。

3討論

紅色熒光蛋白作為一種分子標(biāo)簽，在蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。與其他胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位的方法[13]相比，構(gòu)建紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體具有耗時短、易于觀察目的蛋白、操作簡便、不影響細(xì)胞活性等優(yōu)點。本試驗構(gòu)建了4個紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體并在原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)，結(jié)果表明，pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-[JP3]NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4個紅色熒光蛋白融合表達(dá)載體都可以在擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中很好的表達(dá)，從而指示目的蛋白在細(xì)胞中的定位和分布。

參考文獻(xiàn)：

[1]Prasher D C，Eckenrode V K，Ward W W，et al. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein[J]. Gene，1992，111（2）：229-233.

[2]Ehrenberg M，羅文新，夏寧邵. 綠色熒光蛋白——發(fā)現(xiàn)、表達(dá)和發(fā)展[J]. 生物物理學(xué)報，2008，24（6）：422-429.

[3]吳瑞，張樹珍. 綠色熒光蛋白及其在植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2005，3（2）：240-244.

[4]Matz M V，F(xiàn)radkov A F，Labas Y A，et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species[J]. Nature Biotechnology，1999，17（10）：969-973.

[5]Baird G S，Zacharias D A，Tsien R Y. Biochemistry，mutagenesis，and oligomerization of DsRed，a red fluorescent protein from coral[J]. PNAS，2000，97（22）：11984-11989.[HJ1.7mm]

[6]Yarbrough D，Wachter R M，Kallio K，et al. Refined crystal structure of DsRed，a red fluorescent protein from coral，at 2.0-A resolution[J]. PNAS，2001，98（2）：462-467.

[7]Wall M A，Socolich M，Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed[J]. Nature Structural Biology，2000，7（12）：1133-1138.

[8]Bevis B J，Glick B S. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein （DsRed）[J]. Nature Biotechnology，2002，20（1）：83-87.

[9]Campbell R E，Tour O，Palmer A E，et al. A monomeric red fluorescent protein[J]. PNAS，2002，99（12）：7877-7882.

[10]Shaner N C，Campbell R E，Steinbach P A，et al. Improved monomeric red，orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein[J]. Nature Biotechnology，2004，22（12）：1567-1572.

[11]Bindels D S，Haarbosch L，van Weeren L，et al. mScarlet：a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging[J]. Nature Methods，2017，14（1）：53-56.

[12]Geldner N，Denervaud-Tendon V，Hyman D L，et al. Rapid，combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set[J]. Plant Journal，2009，59（1）：169-178.

[13]范小燕，楊柳，季英華，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒CP基因克隆及亞細(xì)胞定位[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，34（2）：281-287.