王文旭　郁飛

摘要：為進一步研究目的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位，構建融合了紅色熒光蛋白mCherry或mScarlet的表達載體。選取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61等4個定位基因來構建紅色熒光蛋白融合表達載體。根據(jù)TAIR數(shù)據(jù)庫中相關蛋白質(zhì)的基因序列設計引物，通過PCR技術擴增序列并將其分別連接到已制備好的紅色熒光蛋白融合表達載體上，制備得到質(zhì)粒后轉化入原生質(zhì)體進行瞬時表達。結果表明，成功構建了pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4個紅色熒光蛋白融合表達載體，并且成功在擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體中瞬時表達。

關鍵詞：紅色熒光蛋白;融合表達載體;亞細胞定位;瞬時表達

中圖分類號： Q943.2;S188+.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0052-04

熒光蛋白作為一種分子標簽，在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位以及動態(tài)示蹤等方面有著廣泛的應用。相較于其他分子標記，熒光蛋白更加易于和目的蛋白融合，對活細胞毒性小，應用更加便利。綠色熒光蛋白（GFP）是最早被發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白，由日本著名化學家、海洋生物學家下村修從維多利亞水母中首次發(fā)現(xiàn)[1]。GFP通過一系列體外分子進化，發(fā)展出了多種熒光波長不同、發(fā)光強度更高的熒光蛋白，如EGFP（增強型綠色熒光蛋白）、BFP（藍色熒光蛋白）、CFP（青色熒光蛋白）等[2]。這些熒光蛋白極大地豐富了相應的試驗體系和技術，但由于這些熒光蛋白的發(fā)射波長均在440～529 nm[3]，容易激發(fā)胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生熒光，導致成像時背景較高，限制了這些熒光蛋白的應用。

1999年Matz等報道了第一個紅色熒光蛋白DsRed（drFP583）[4]。DsRed自香菇珊瑚中分離得到，具有激發(fā)和發(fā)射波長較長、細胞內(nèi)成像背景較低等優(yōu)點，但在實際應用時常會以二聚體或四聚體形式出現(xiàn)，對組織、器官和細胞有一定的毒性，且在空間上限制了一些蛋白質(zhì)的功能，從而影響了對目的蛋白的標記[5-7]。為解決DsRed的上述缺陷，在隨后的研究過程中，Bevis等應用多種體外分子進化的手段，對DsRed進行了一系列的改造，最終得到了穩(wěn)定地以單體形式存在的紅色熒光蛋白mRFP[8-9]。mRFP有波長較長、半成熟時間較短、不易聚合等一系列優(yōu)點，大大拓展了紅色熒光蛋白的應用領域。Shaner等在mRFP的基礎上，對其發(fā)色基團附近的位點進行突變，經(jīng)過多輪突變、篩選、加帽加尾等過程得到了mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry及mCherry等一系列波長不同的單體紅色熒光蛋白[10]。2017年，Bindels等以mCherry為模板，經(jīng)過多輪突變改造得到了一個新的熒光蛋白mScarlet。這一新的單體紅色熒光蛋白在發(fā)光強度、波長、熒光壽命等方面均有更優(yōu)的性能[11]。

本研究擬通過構建熒光蛋白融合表達載體，將其轉入原生質(zhì)體過表達的方式，運用激光共聚焦顯微技術來進行目的蛋白的胞內(nèi)定位研究。筆者選用pUC18HE-mCherry和pUC18HE-mScarlet NT 2個不同的紅色熒光蛋白表達載體，選取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61[12]作為定位基因，來構建4個紅色熒光蛋白融合表達載體。將構建好的紅色熒光蛋白融合表達載體轉入野生型擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體中過表達，之后觀察細胞中融合紅色熒光表達蛋白的定位情況。

1材料與方法

1.1試驗時間與地點

試驗于2017年5—8月在西北農(nóng)林科技大學生命科學學院郁飛實驗室進行。

1.2材料

1.2.1植株、細菌和載體野生型擬南芥植株（Col-0），由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院賈敏博士提供;大腸桿菌TOPl0、紅色熒光蛋白融合表達載體pUC18HE-mCherry和pUC18-mScarlet NT，由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院植物分子遺傳實驗室保存。

1.2.2主要工具酶與試劑限制性內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）等均購自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher科技（中國）有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司;金牌超量無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.13種紅色熒光蛋白的同源性比對

在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）數(shù)據(jù)庫中搜索出mRFP、 mCherry和mScarlet的DNA序列。將這3條DNA序列以Fasta格式輸入至NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORFfinder，翻譯為蛋白序列。將mRFP、mCherry和mScarlet的蛋白序列以Fasta格式輸入EMBL數(shù)據(jù)庫的程序Clustal Omega，之后再使用ExPasy上的Box Shade工具修飾所得數(shù)據(jù)，得到序列對比結果。對比結果中黑色部分代表這3個蛋白一級結構的相應位置上完全相同的氨基酸殘基，灰色部分代表部分相同的氨基酸殘基，consensus中星號（*）對應完全相同的氨基酸殘基序列，點號（.）對應部分相同的氨基酸殘基序列。

1.3.2融合表達載體的選取和構建選取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61 4個定位基因來構建紅色熒光蛋白融合表達載體。根據(jù)TAIR網(wǎng)站公布的擬南芥VTI12基因和RabD2a基因的序列設計引物擴增這2個基因的CDS（蛋白質(zhì)編碼區(qū)）序列，引物序列如表1所示。

表1中引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。以野生型擬南芥cDNA為模板，分別用上述引物進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物進行回收后與融合紅色熒光蛋白表達載體pUC18HE-mCherry分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切時在載體中加入1 μL CIAP（牛小腸堿性磷酸酶，用于防止載體自連）;ARA7以及SYP61在筆者所在實驗室前期工作中已經(jīng)合成，故直接與表達載體pUC18-mScarlet NT分別用 BamHⅠ 和XhoⅠ雙酶切即可。將酶切后的片段與載體用T4 DNA連接酶于22 ℃恒溫器中反應2 h，將得到的連接產(chǎn)物與大腸桿菌TOPl0進行轉化后涂布于抗性LB培養(yǎng)基上進行抗性篩選，利用堿性裂解法提取質(zhì)粒進行酶切驗證，將連接正確的質(zhì)粒送至華大基因生物科技（深圳）有限公司進行序列測定。測定序列無誤后，用金牌無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，以獲得較高濃度的質(zhì)粒（>1 mg/μL）。將得到的質(zhì)粒保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。

1.3.3原生質(zhì)體的制備與瞬時轉化

首先配制酶解液：向酶解緩沖液中加入1% 纖維素酶R10和0.2%果膠酶R10，然后將酶解液于55 ℃水浴10 min，以促進纖維素酶和離析酶的溶解并且抑制蛋白酶的活性;待水浴后溶液冷卻至室溫，加入1%的1 mol/L CaCl2溶液、0.035%的β-巰基乙醇和0.1%的BSA（牛血清白蛋白）。將配制好的酶解液用0.45 μm濾膜過濾以除去溶液中的雜質(zhì)。用鋒利的小剪刀剪取3～4周齡的野生型擬南芥葉片，保留較長的葉柄，且選取平展嫩綠的葉片。將葉片用清水輕柔沖洗干凈后用鋒利的刀片切成約 1 mm 寬的細條，然后將切好的葉片浸沒在適量酶解液中。于真空干燥罐中抽氣30 min，使酶解液充分浸潤葉片。隨后在黑暗環(huán)境中 40 r/min 水平搖晃酶解混合液90 min，90 r/min水平搖晃 1 min 以釋放酶解產(chǎn)生的球狀原生質(zhì)體，此時酶解液呈綠色。向酶解液中加入10 mL W5溶液（含154 mmol/L NaCl 9.0 g，125 mmol/L CaCl2 18.38 g，5 mmol/L KCl 0.372 g，2 mmol/L MES 0.42 g，用H2O定容至1 L。用 1 mol/L KOH調(diào)pH值至5.7，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃冷藏保存），輕柔搖晃后用35～75 μm的尼龍膜將酶解液過濾到圓底離心管中。4 ℃低溫300 r/min水平離心5 min，除去上層清液后用10 mL冰預冷的W5溶液輕柔重懸管底細胞。如此再次重懸細胞1次后將混合液冰浴40 min。冰浴時可吸取少量細胞鏡檢，檢查原生質(zhì)體是否健康完整。冰浴后將細胞懸浮液于4 ℃低溫 300 r/min 水平離心5 min，用適量MMg溶液（含0.4 mol/L甘露醇72.86 g，15 mmol/L MgCl2 3.05 g，4 mmol/L MES[2-（N-嗎啡啉）乙磺酸]0.58 g，用H2O定容至1 L。用1 mol/L KOH調(diào)pH值至5.7，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃冷藏保存）重懸細胞。吸取200 μL懸浮液于 2 mL 離心管中，加入約30 μL（質(zhì)粒濃度1 μg/μL）已制備好的質(zhì)粒和230 μL的40% PEG（聚乙二醇）溶液，輕柔混勻后室溫孵育25 min。之后加入800 μL W5溶液，輕柔混勻后于4 ℃低溫 500 r/min 水平離心5 min，除去上層PEG混合液。加入1 mL W5溶液重懸細胞于6孔板中，置于22 ℃恒溫培養(yǎng)基中 40 r/min 水平搖床上黑暗孵育8～16 h。孵育之后在激光共聚焦顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達。

2結果與分析

2.13種紅色熒光蛋白的同源性比對及空間結構預測

由蛋白序列比對的結果（圖1）可以看出mRFP、mCherry和mScarlet 3種紅色熒光蛋白序列的分子體外進化過程，以及在體外分子進化的過程中，由mRFP到mCherry以及到mScarlet所進行的加帽、加尾和點突變等改造。

2.2融合表達載體的構建

2.2.1PCR擴增結果與酶切

在TAIR網(wǎng)站查找獲得擬南芥VTI12基因和RabD2a基因的cDNA序列，以野生型擬南芥Col-0 cDNA為模板，用帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物，分別擴增出與預期669 bp大小吻合的條帶以及與預期612 bp大小吻合的條帶（圖2）。

回收目的條帶并將目的片段與融合紅色熒光蛋白表達載體pUC18HE-mCherry均用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切后產(chǎn)生約669 bp大小的VTI12的目的條帶、約612 bp大小的RabD2a的目的條帶以及4.7 kb大小的載體條帶（圖3），回收酶切片段。

將筆者所在實驗室前期工作中已經(jīng)合成的ARA7以及SYP61與融合紅色熒光蛋白表達載體pUC18-mScarlet NT均用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切后產(chǎn)生約603 bp大小的ARA7的目的條帶、約738 bp大小的SYP61的目的條帶以及4.5 kb大小的載體條帶（圖4），回收酶切片段。

2.2.2紅色熒光蛋白融合表達載體的鑒定

將帶黏性末端的目的片段與載體相連，取陽性克隆提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒后進行酶切驗證（圖5），酶切驗證正確無誤后進行測序，測序結果表明pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4個紅色熒光蛋白融合表達載體構建成功。重組質(zhì)?；蚪Y構如圖6及圖7所示。

2.3原生質(zhì)體細胞瞬時表達紅色熒光蛋白的結果

將上述構建好的4個紅色熒光蛋白融合表達載體瞬時轉化入已制備好的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體中進行過表達，之后[CM（25]進行共聚焦照相，得到的結果如圖8所示。由圖8可知，[CM（26]pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61均可在原生質(zhì)體葉肉細胞中很好地表達。

3討論

紅色熒光蛋白作為一種分子標簽，在蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)定位等方面有著廣闊的應用前景。與其他胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位的方法[13]相比，構建紅色熒光蛋白融合表達載體具有耗時短、易于觀察目的蛋白、操作簡便、不影響細胞活性等優(yōu)點。本試驗構建了4個紅色熒光蛋白融合表達載體并在原生質(zhì)體中瞬時表達，結果表明，pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-[JP3]NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4個紅色熒光蛋白融合表達載體都可以在擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體中很好的表達，從而指示目的蛋白在細胞中的定位和分布。

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