劉超英　董骎　高洪　嚴(yán)玉霖　富國文　單春蘭

摘要：為了探討泛素（ubiquitin，簡稱Ub）對TLR4/NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子表達(dá)的影響，通過脂質(zhì)體將短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬小腸上皮細(xì)胞，使其泛素基因沉默，于轉(zhuǎn)染后6、12、24、48 h收集細(xì)胞及其上清。應(yīng)用熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子TLR4、NF-κB、MyD88、IκB-α的mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測NF-κB、IκB-α及炎性因子TNF-α、IL-1含量的變化。結(jié)果顯示，shRNA質(zhì)粒有效地抑制了泛素基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒后，TLR4/NF-κB信號通路中TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α的mRNA表達(dá)量及NF-κB、IκB-α、TNF-α和IL-1含量均普遍呈下降的趨勢，說明泛素在炎性因子的釋放中起著至關(guān)重要的作用，泛素基因的沉默能夠抑制該通路的活化。

關(guān)鍵詞：泛素;基因沉默;信號通路;炎性因子

中圖分類號： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0037-04

泛素-蛋白酶體途徑是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的非常重要的、依賴于腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的蛋白質(zhì)降解途徑，可以從多個(gè)環(huán)節(jié)參與調(diào)控NF-κB信號通路[1-3]。泛素（ubiquitin，簡稱Ub）作為該途徑的重要組成部分，可以降解TLR4/NF-κB信號通路中的IκB，使NF-κB游離到細(xì)胞核內(nèi)參與炎性因子的合成，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[4-6]。當(dāng)該途徑受到抑制時(shí)，會導(dǎo)致活性NF-κB的產(chǎn)生量減少，抗凋亡蛋白的水平隨之降低，使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[7]。

短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs，簡稱shRNAs）是能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小RNA分子，因其具有特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在哺乳動物細(xì)胞中可以長期甚至穩(wěn)定地發(fā)揮RNA干擾作用，而不引起非特異性反應(yīng)。因此，目前shRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)已經(jīng)成為研究哺乳動物細(xì)胞內(nèi)外基因功能強(qiáng)有力的工具[8-10]。為了研究泛素基因?qū)LR4/NF-κB信號通路的作用，本研究利用shRNA干擾技術(shù)對豬小腸上皮細(xì)胞的泛素基因進(jìn)行沉默，并對TLR4/NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，不僅可以為基因沉默的相關(guān)研究提供理論依據(jù)，還可以為從蛋白降解角度尋找治療炎癥類疾病的新思路奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2），購自廣州吉尼歐生物有限公司;焦碳酸二乙酯（DEPC）、2×Easy Taq PCR Super Mix，購自北京百泰克生物有限公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，購自Lifetechnologies公司;胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶溶液[025% 胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）]，購自Gibico公司;DMEM高糖培養(yǎng)基，購自Hyclone公司。本試驗(yàn)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物病理實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1豬小腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)于37 ℃水浴，使IPEC-J2盡量在1 min內(nèi)完全融化，于4 000 r/min離心5 min，加入 1 mL DMEM培養(yǎng)液將底部細(xì)胞吹打均勻后，注入含有6 mL DMEM培養(yǎng)液和10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕緩搖晃使細(xì)胞均勻分布，然后置于37 ℃、5% CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2shRNA質(zhì)粒的設(shè)計(jì)及構(gòu)建根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站中的豬泛素基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)針對豬泛素基因保守區(qū)的shRNA序列UBC-sus-263（5′-GAGAACGTCAAGGCGAAGATC-3′），并設(shè)計(jì)陰性對照 UBC-shNC（5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′），質(zhì)粒載體為U6/GFP/Neo，帶綠色熒光標(biāo)記，由上海吉瑪制藥公司合成。將質(zhì)粒DNA溶液于-20 ℃保存，對應(yīng)的甘油菌液于 -80 ℃ 保存。

1.2.3泛素基因沉默在六孔板中培養(yǎng)IPEC-J2細(xì)胞，當(dāng)匯合度達(dá)到80%左右時(shí)將培養(yǎng)液換為2 mL無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為空白細(xì)胞對照組、shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)6、12、24、48 h時(shí)收集細(xì)胞及其上清。

1.2.4引物設(shè)計(jì)本試驗(yàn)選用β-actin作為內(nèi)參基因，在NCBI網(wǎng)站中查找公開發(fā)表的β-actin、TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α基因序列，遵循實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）的引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由深圳華大基因股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.2.5Real-Time PCR提取細(xì)胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄說明書于冰上配制反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后按下列組分配制熒光定量PCR反應(yīng)液：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RnaseH Plus）（2×），各0.7 μL PCR上下游引物（10 μmol/L），2.0 μL模板，9.1 μL dH2O，將上述反應(yīng)液加入0.2 mL八聯(lián)排管中混勻，離心，在Bio-Rad Real-Time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序設(shè)置如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，Tm 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);溶解曲線55 ℃ 30 s，81個(gè)循環(huán)。結(jié)束后保存數(shù)據(jù)，并計(jì)算各指標(biāo)的mRNA相對表達(dá)量。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測采集不同時(shí)期各處理組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒檢測IκB-α、NF-κB 及炎性因子 IL-1、TNF-α的含量。

1.2.7數(shù)據(jù)處理本試驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*5]±s）表示，用單因素方差分析比較各組均值的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒后IPEC-J2細(xì)胞中泛素基因的表達(dá)情況

根據(jù)24、48 h的反應(yīng)循環(huán)數(shù)（CT值），計(jì)算shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞后Ub基因的mRNA相對表達(dá)量。如圖1所示，UBC-sus-263的shRNA質(zhì)粒對泛素基因的沉默效果較好，在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，其表達(dá)量均僅為空白細(xì)胞組的2%，表現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。

2.2IPEC-J2細(xì)胞中TLR4、NF-κB、IκB-α 及MyD88的mRNA表達(dá)量

由圖2-A可以看出，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，細(xì)胞內(nèi)的TLR4表達(dá)量明顯降低，相較于對照組顯示出極顯著差異，在24 h時(shí)降至最低值。而空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)的TLR4表達(dá)量較空白細(xì)胞組略微升高，6 h時(shí)差異極顯著，24 h時(shí)差異顯著，其他時(shí)間點(diǎn)差異不明顯。由圖2-B可以看出，shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，細(xì)胞內(nèi)的 NF-κB 表達(dá)量明顯降低，相較于對照組表現(xiàn)出極顯著差異，在12 h時(shí)降至最低值。而空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)的NF-κB表達(dá)量較空白細(xì)胞組升高，在6 h時(shí)與對照組相比差異顯著，12、48 h與空白對照組相比表現(xiàn)出極顯著差異。由圖2-C可以看出，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，細(xì)胞內(nèi)的IκB-α表達(dá)量明顯降低，相較于對照組表現(xiàn)出極顯著差異，在24 h時(shí)降至最低值。而空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)的IκB-α表達(dá)量較空白細(xì)胞組呈上升趨勢，12、24 h時(shí)與空白對照組差異顯著，48 h 時(shí)差異極顯著。由圖2-D可以看出，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，細(xì)胞內(nèi)的MyD88表達(dá)量明顯降低，相較于對照組顯示出極顯著差異，在48 h時(shí)降至最低值。而空白質(zhì)粒組在6、48 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)的MyD88表達(dá)量較空白細(xì)胞組略微升高，而12、24 h時(shí)的表達(dá)量略微降低，與空白對照組間差異不顯著。

2.3IPEC-J2細(xì)胞中細(xì)胞因子的ELISA檢測結(jié)果

由圖3-A可以看出，在各時(shí)間點(diǎn)，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的NF-κB含量明顯低于空白細(xì)胞組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，6 h時(shí)與空白組間差異極顯著，其余時(shí)間均顯示出顯著差異。由圖3-B可以看出，在轉(zhuǎn)染12～48 h，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的IκB-α含量明顯低于空白細(xì)胞組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，并在12、48 h時(shí)與空白對照間顯示出顯著差異，24 h時(shí)差異極顯著。由圖3-C可以看出，在各時(shí)間點(diǎn)，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的TNF-α含量明顯低于空白細(xì)胞組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，并在6、24、48 h時(shí)與空白對照組間顯示出極顯著差異，12 h時(shí)差異顯著。由圖3-D可以看出，在各時(shí)間點(diǎn)，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的IL-1含量明顯低于空白細(xì)胞組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，并在24、48 h時(shí)與對照組顯示出極顯著差異，在6、12 h時(shí)與空白對照組間差異顯著。

3討論

在TLR4/NF-κB信號通路中，泛素扮演著重要的角色，研究認(rèn)為，很多泛素化抑制因子可以作為治療許多疾病的新靶點(diǎn)[11-14]。Marfella等的研究表明，通過免疫組織化學(xué)方法和酶聯(lián)免疫分析的方法，應(yīng)用羅格列酮抑制泛素-蛋白酶體途徑，可以通過減少IκB（轉(zhuǎn)錄核因子κB抑制子）的降解，從而抑制與NF-κB相關(guān)的炎癥過程[15]。目前，針對泛素蛋白酶體系統(tǒng)的生物學(xué)靶點(diǎn)已經(jīng)在蛋白酶體抑制劑與E1（泛素活化酶）、E2（泛素結(jié)合酶）、E3（泛素連接酶）方面得到擴(kuò)展。在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，泛素分子都呈高表達(dá)狀態(tài)[16]。Choongseob等通過降低泛素UBB基因的表達(dá)量而成功抑制了體內(nèi)、外腫瘤細(xì)胞的生長，其機(jī)制是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)NF-κB分子通路實(shí)現(xiàn)的[17-18]。因此可見，泛素化是調(diào)節(jié)NF-κB活化的一種重要機(jī)制。

在本試驗(yàn)中，通過構(gòu)建shRNA質(zhì)粒對泛素基因進(jìn)行沉默，下調(diào)或終止其表達(dá)，可以達(dá)到抑制泛素蛋白合成的目的，研究轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后對豬小腸上皮細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號通路的作用。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)TLR4的mRNA表達(dá)量比空白對照組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組低，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間增加，表達(dá)量逐漸降低，并在24 h時(shí)降至最低值;NF-κB的mRNA表達(dá)量也明顯低于空白細(xì)胞組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，在12 h時(shí)降至最低值后逐漸升高，但仍低于空白細(xì)胞組中的NF-κB含量;IκB-α、MyD88的mRNA表達(dá)量也都低于同組的空白細(xì)胞組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，并且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，mRNA的表達(dá)量逐漸降低，均在24 h時(shí)出現(xiàn)最小值。試驗(yàn)結(jié)果表明，泛素基因沉默以及泛素的表達(dá)量下調(diào)，對TLR4/NF-κB信號通路起到了抑制作用，各下游分子的表達(dá)量均出現(xiàn)降低，其抑制作用很可能是通過抑制泛素化降解IκB而實(shí)現(xiàn)的。

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