鈺華　李爽　蓋穎

摘要：從毛白楊中克隆得到木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶PtoXTH35基因，根據SignalIP在線軟件預測蛋白信號肽，并分別構建至pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a等5種原核表達載體，經雙酶切和測序驗證后轉化至BL21（DE3）感受態(tài)，使用終濃度為0.4 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導其表達目的蛋白。經SDS-PAGE檢測，結果表明5種載體均可表達目的蛋白，pET28a、pET32a、pGEX-4t-1等3種載體所表達蛋白均以包涵體的形式存在，而pMAL-c5e和pET 43.1a載體攜帶蛋白表達量高并且所表達蛋白50%為可溶性蛋白，實現了毛白楊PtoXTH35在原核表達系統(tǒng)中的高效可溶性表達，該試驗為后續(xù)進一步研究毛白楊PtoXTH35的體外功能奠定了基礎。

關鍵詞：毛白楊;木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶;原核表達;包涵體;可溶性蛋白

中圖分類號： S792.117.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0033-04

在植物的生長發(fā)育以及抵御生物和非生物脅迫過程中，細胞壁發(fā)揮著不可忽視的作用。在雙子葉植物的初生細胞壁中，木葡聚糖以非共價鍵的形式與纖維素相連，從而形成了初生細胞壁當中主要的張力承載結構，木葡聚糖水解酶（xyloglucan endohydrolase，XEH）可以快速催化木葡聚糖的水解從而實現細胞壁的膨脹[1]。Albersheim等做出假設認為在植物細胞生長過程中還存在一種糖苷內部轉移酶，將多糖鏈的一部分轉移至自身的其他位置[2]。隨后Fry等率先發(fā)現了一種蛋白可以在快速生長的植物細胞當中催化木葡聚糖鏈的斷裂以及重連，并命名為木葡聚糖內轉糖苷酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）[3]，XET和XEH共同組成了木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶（xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase，XTH）家族，被認為是一種細胞壁松弛酶，在植物生長過程中以及抵御外界脅迫過程中參與了細胞壁重構。XTH是一類龐大的多基因家族，屬于碳水化合物活性酶家族數據庫（CAZy）中的糖苷水解家族GH16。在毛果楊、擬南芥中已經發(fā)現了該基因家族中分別含有41、33個成員[4]，根據XTH蛋白編碼的氨基酸序列以及蛋白質的結構可以將它們分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3類，其中Ⅰ和Ⅱ類具有糖基轉移酶活性，Ⅲ類具有糖苷水解酶活性[5]。

目前對于XTH的研究主要集中在對該基因家族成員的功能鑒定及其在植物生長發(fā)育和抵御外界脅迫過程中發(fā)揮作用的機制，而要對基因家族中的成員進行體外功能驗證則必須要實現蛋白的體外可溶性表達。目前文獻中多采用酵母表達方法獲得XTH可溶性蛋白，只有極少數文獻報道通過原核表達以及包涵體變復性的方法獲得可溶性蛋白，這可能是受限于XTH在原核系統(tǒng)中多以包涵體的形式表達[6-10]。因此，本研究擬通過更換攜帶有不同可溶性標簽的載體以實現毛白楊PtoXTH35（Populus tomentosa xyloglucan endotransgl-ycosylase/hydrolase 35）蛋白在原核中的高效可溶性表達，以期為后續(xù)功能驗證等相關試驗奠定基礎。

1材料與方法

試驗于2016年10月至2017年3月在北京市海淀區(qū)北京林業(yè)大學進行。

1.1質粒和菌株

pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a質粒載體以及大腸桿菌（Escherichia coli） BL21（DE3）、JM109菌株均由筆者所在實驗室保留。

1.2試劑

胰蛋白胨、酵母粉均購自Oxiod公司;Taq酶、T4連接酶、限制性內切酶、2 ku DNA Maker、10 ku DNA Maker，均購自寶生物工程（大連）有限公司;蛋白質分子量標準，購自中國科學院上海生物化學研究所;其他化學試劑均購自北京藍弋化工產品有限責任公司。

1.3主要儀器

POWER PAC 300電泳儀（美國BIO-RED公司），Universal Hood Ⅱ型凝膠成像儀（美國BIO-RED公司），ABI Veriti FAST 梯度PCR儀（美國Applied Biosystems公司），DNA Engine連接儀（美國BIO-RED公司），SHK-02-Ⅰ臺式空氣恒溫搖床（北京北方同正生物技術發(fā)展有限公司），JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝科器研究所）。

1.4試驗方法

1.4.1毛白楊PtoXTH35基因克隆與序列分析

通過在NCBI上查找得到毛果楊PtrXTH35基因序列信息，利用DNAMAN設計正向引物5′-ATGGCTGTTTCAGTCTTTAAG-3′和反向引物5′-CTAGTGGTGGCGGTGGCT-3′。以毛白楊的cDNA為模板進行PCR擴增，反應程序為95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用DNA純化回收試劑盒進行膠回收并送至北京睿博興科生物技術有限公司測序，將測序所得序列與毛果楊PtrXTH35序列進行比對。

1.4.2原核表達載體的構建

利用DNAMAN將測序得到的PtoXTH35的DNA序列翻譯為氨基酸序列并上傳至SignalIP和TMHMM 2.0在線軟件分析信號肽序列和跨膜區(qū)，以去除信號肽的序列為模板設計引物，利用PCR方法為目的基因兩端加上酶切位點，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后用相應的限制性內切酶進行酶切并回收目的片段，同時用相應的限制性內切酶對質粒載體pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a進行酶切回收，之后將酶切的載體和目的片段利用T4連接酶連接，將連接液經CaCl2法轉化至JM109感受態(tài)，待長出單克隆后搖菌提取質粒進行酶切鑒定。載體構建引物及酶切位點如表1所示。

1.4.3PtoXTH35蛋白原核表達

將構建好的載體pET28a-PtoXTH35、pET32a-PtoXTH35、pGEX-4t1-PtoXTH35、pMAL-c5e-PtoXTH35、pET 43.1a-PtoXTH35轉化至E. coli BL21（DE3）感受態(tài)并用抗生素篩選陽性菌株，挑取陽性單克隆接種于5 mL含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，之后將5 mL菌液接種于 100 mL 含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至 D600 nm=0.4左右，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.4 mmol/L。 28 ℃誘導表達4 h，6 000 r/min 離心10 min收集菌體，加入4倍體積50 mmol/L Tris-HCl（pH值為8.0）緩沖液重懸，經超聲破碎后 12 000 r/min 離心，取上清和沉淀加入等體積蛋白上樣緩沖液，沸水中煮5 min后離心取上清，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定蛋白表達。

2結果與分析

2.1毛白楊PtoXTH35基因克隆與序列分析

經PCR擴增得到如圖1所示的DNA片段，測序獲得毛白楊PtoXTH35核酸序列，與毛果楊PtrXTH35序列比對相似度高達98.32%（圖2），證實該序列為毛白楊PtoXTH35基因片段，該序列全長888 bp，由269個氨基酸組成，所翻譯的蛋白質分子量為33.69 ku，經SignalIP和TMHMM 2.0在線軟件分析該蛋白N端存在跨膜區(qū)可能為信號肽序列，且推測信號肽裂解位點位于第25和第26個氨基酸之間（圖3、圖4）。

2.2原核表達載體的構建

將5個載體的陽性質粒經雙酶切進行驗證，分別選用表碼和突變，可以用于下一步的誘導表達。

2.3PtoXTH35蛋白的原核誘導表達

將5種重組質粒分別轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，經0.4 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)4 h后收集菌體，取全菌以及經超聲破碎后的沉淀和上清液煮沸后經12% SDA-PAGE檢測蛋白表達，由于5種原核表達載體均攜帶了分子量不同的可溶性蛋白標簽，因此所表達的融合蛋白分子量并不相同，根據計算獲得融合蛋白分子量的理論值，pET28a攜帶了1個 6×His標簽，融合蛋白分子量約為32 ku;pET32a攜帶了1個19 ku的硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx），融合蛋白分子量約為51 ku;pGEX-4t-1攜帶了1個27 ku的谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S transferase，GST），融合蛋白分子量約為 59 ku;pMAL-c5e攜帶了1個40 ku的麥芽糖結合蛋白（maltose-binding protein，MBP），融合蛋白分子量約為72 ku;pET 43.1a攜帶了1個60 ku的轉錄終止抗終止因子（N-utilization substance，Nus），融合蛋白分子量約為92 ku。結果表明，經IPTG誘導，攜帶5種重組載體的大腸桿菌均成功表達了融合蛋白，并且分子量與理論分子量相符合（圖6）。但五種原核表達載體所表達蛋白的表達量以及可溶性表達情況并不相同，其中pET28a蛋白表達量最高，但蛋白幾乎全部以包涵體形式存在;pGEX-4t-1和pET32a蛋白表達量較低，并且所表達蛋白同樣以包涵體形式存在;而pMAL-c5e和pET 43.1a蛋白表達量較高，而可溶性蛋白含量與包涵體蛋白大致相同，因此可溶性蛋白達到了總表達蛋白的50%左右，實現了PtoXTH蛋白在原核表達系統(tǒng)中的高效可溶性表達。

3結論

XTH基因廣泛存在于植物中，在植物細胞壁修飾中發(fā)揮重要作用，其龐大的基因家族中存在眾多還未明確得到功能驗證的成員，因此迫切需要對該家族中成員進行體外和體內功能驗證，包括活性測定以及體外蛋白互作研究則須要獲得可溶性的目的蛋白。現有報道XTH的原核表達往往會形成包涵體，大部分文獻中采用酵母表達的方法獲得XTH蛋白，但酵母表達方法耗時較長，并且純化步驟較為繁瑣，對表達條件也更為敏感，本研究更換了5種攜帶有不同可溶性標簽的原核表達載體，通過嘗試發(fā)現攜帶有MBP蛋白的pMAL-c5e和攜帶有Nus因子的pET 43.1a均可實現PtoXTH35蛋白在原核表達系統(tǒng)中的高效可溶性表達，與大部分文獻中[6-9]通過酵母表達獲得XTH蛋白的方法相比，縮短了試驗周期，并且表達條件穩(wěn)定，純化步驟相較酵母表達也更為簡單，這為后續(xù)深入研究毛白楊PtoXTH35的生物學功能奠定了基礎。

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