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        Etest方法與微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌屬對(duì)唑類抗真菌藥物的敏感性評(píng)價(jià)*

        2019-08-20 01:47:32徐英春
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

        張 麗,王 賀,肖 盟,徐英春

        (1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100730;2.侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730)

        近年來念珠菌感染的發(fā)病率逐漸增加,成為引起院內(nèi)感染的重要致病菌[1-2]。唑類藥物是用于治療念珠菌感染常用藥物,但隨著臨床抗真菌藥物的廣泛使用,開始出現(xiàn)耐藥菌株,因此及時(shí)準(zhǔn)確的體外藥物敏感性檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)臨床抗真菌治療具有重要的意義[3-4]。美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute,CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法(broth microdilution method,BMD)為金標(biāo)準(zhǔn),但操作繁瑣,耗時(shí)耗力,限制了其在臨床中的應(yīng)用[5]。Etest藥敏試驗(yàn)方法是改良的瓊脂擴(kuò)散法,又稱為濃度梯度法,是使用預(yù)先制備的含梯度抗生素藥物濃度的試紙條,貼在已涂布真菌的平板后,經(jīng)過一段時(shí)間孵育,根據(jù)抑菌環(huán)大小可以讀出相應(yīng)藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)值。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)唑類藥物Etest藥敏方法評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)較少,因此本試驗(yàn)將以微量肉湯稀釋法作為標(biāo)準(zhǔn),評(píng)價(jià)研究Etest法檢測(cè)常見念珠菌氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的準(zhǔn)確性。

        1材料與方法

        1.1 菌株來源 測(cè)試5種念珠菌均來源于侵襲性真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHIF-NET),其中白念珠菌80株,熱帶念珠菌40株,光滑念珠菌40株,近平滑念珠菌40株和克柔念珠菌20株。質(zhì)控菌株包括ATCC22019近平滑念珠菌,ATCC90028白念珠菌和ATCC6528克柔念珠菌。

        1.3 方法

        1.3.1 微量肉湯稀釋法:微量肉湯稀釋法操作嚴(yán)格按CLSI M27文件操作[5]??拐婢幬餀z測(cè)濃度范圍:氟康唑0.125~64 μg/ml,伏立康唑0.03~16 μg/ml,伊曲康唑0.03~16 μg/ml。35°C孵育24 h后讀取藥敏結(jié)果。

        1.3.2 Etest方法:檢測(cè)方法主要參考廠家說明。用生理鹽水制成0.5 MCF濃度的菌懸液;用無菌拭子沾菌液后擠干,輕輕在RPM1640瓊脂表面均勻密涂;將Etest條貼在瓊脂表面;35°C孵育24 h后讀取藥敏結(jié)果。抗真菌藥物檢測(cè)濃度范圍:氟康唑0.016~256 μg/ml,伏立康唑0.002~32 μg/ml,伊曲康唑0.002~32 μg/ml。

        1.3.3 藥敏結(jié)果判定:根據(jù)CLSI M60[6]對(duì)氟康唑和伏立康唑的敏感性進(jìn)行判定。對(duì)于白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌,氟康唑:敏感(susceptible,S)≤2 μg/ml;劑量依賴性敏感(susceptible-dose dependent,SDD)4 μg/ml;耐藥(resistant,R)≥8 μg/ml;伏立康唑:S≤0.12 μg/ml;中介(intermediate,I)0.25~0.5 μg/ml;R≥1 μg/ml。光滑念珠菌,氟康唑:SDD≤32 μg/ml,R≥64 μg/ml;伏立康唑無折點(diǎn)。克柔念珠菌,無氟康唑折點(diǎn);伏立康唑:S≤0.5 μg/ml,I 1 μg/ml,R≥2 μg/ml。

        CLSI M60[6]未規(guī)定伊曲康唑的臨床折點(diǎn),本研究參考CLSI M59[7]文件中伊曲康唑的流行病學(xué)折點(diǎn)(epidemiological cutoff value,ECV)對(duì)菌株界定為野生株(wide-type,WT)或非野生株(non-wide-type,NWT)。光滑念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌的伊曲康唑ECV分別為4,1和0.5 μg/ml。

        1.3.4 結(jié)果比較:分別統(tǒng)計(jì)兩種方法的基本一致率(essential agreement,EA)和分類一致率(categorical agreement,CA)。EA指的是Etest方法和微量肉湯稀釋法的MIC值相差在2個(gè)梯度以內(nèi)。CA指的是Etest方法和微量肉湯稀釋法的判定結(jié)果一致(均為敏感、中介或耐藥)的菌株占總測(cè)定株數(shù)的比率。顯著錯(cuò)誤(very major error,VME),即微量肉湯稀釋法為耐藥,Etest方法測(cè)試為敏感;大錯(cuò)誤(major error,ME),即微量肉湯稀釋法為敏感,Etest方法測(cè)試為耐藥;小錯(cuò)誤(minor error,MiE),即其中一種方法為中介(I)或劑量依賴性敏感(SDD),另外一種方法測(cè)試結(jié)果為敏感(S)或耐藥(R)。

        2結(jié)果

        2.1 Etest方法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類藥物敏感性的基本一致率(EA) 見表1。

        表1 Etest方法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類藥物敏感性的基本一致率(EA)

        注:BMD,微量肉湯稀釋法;EA,基本一致率。

        分別計(jì)算兩種檢測(cè)方法的氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑MIC50和MIC90,除伊曲康唑MIC90相差大于1個(gè)梯度,其余唑類藥物MIC50與MIC90相差均在1個(gè)梯度內(nèi)。對(duì)于氟康唑有7株菌兩種方法MIC值相差2個(gè)梯度以上,其中5株近平滑念珠菌的Etest結(jié)果低于微量肉湯稀釋法2個(gè)梯度以上。對(duì)于伏立康唑有6株菌兩種方法MIC值相差2個(gè)梯度以上,其中4株白念珠菌Etest結(jié)果低于微量肉湯稀釋法2個(gè)梯度以上。對(duì)于伊曲康唑有40株菌兩種方法MIC值相差2個(gè)梯度以上,其中13株熱帶念珠菌和11株近平滑念珠菌Etest結(jié)果低于微量肉湯稀釋法2個(gè)梯度以上,9株光滑念珠菌Etest結(jié)果高于微量肉湯稀釋法2個(gè)梯度以上。

        2.2 Etest方法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類藥物敏感性的分類一致率(CA) 見表2。對(duì)于氟康唑,白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌中兩種檢測(cè)方法的CA一致率均超過90%,Etest檢測(cè)錯(cuò)誤類型均為小錯(cuò)誤。對(duì)于伏立康唑,白念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌中兩種檢測(cè)方法的CA一致率均大于95%,無顯著錯(cuò)誤和大錯(cuò)誤;而熱帶念珠菌兩種方法CA一致率低于90%,其中3株中介株Etest檢測(cè)為敏感,4株耐藥株Etest檢測(cè)為中介。對(duì)于伊曲康唑基于ECV評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)方法一致率,光滑念珠菌一致率僅為70%,有12株光滑念珠菌野生株Etest檢測(cè)為非野生株。

        表2 Etest方法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類藥物敏感性的分類一致率(CA)

        注:BMD.微量肉湯稀釋法;S.敏感;SDD.劑量依賴敏感;I.中介;WT.野生型;NWT.非野生型;CA.分類一致率;VME.顯著錯(cuò)誤;MER.大錯(cuò)誤;MiE.錯(cuò)誤。

        3討論目前真菌體外藥物敏感性試驗(yàn)常用方法包括微量肉湯稀釋法,ATB Fungus 3,Sensititre YeastOne藥敏板、CLSI紙片擴(kuò)散法、丹麥ROSCO紙片擴(kuò)散法和Etest方法。CLSI微量肉湯稀釋法是目前認(rèn)可的金標(biāo)準(zhǔn)方法,但是操作比較復(fù)雜,耗時(shí)耗力,結(jié)果不易判讀[5]。ATB Fungus 3和Sensititre YeastOne藥敏板為商品化改良微量肉湯稀釋法。CLSI紙片擴(kuò)散法和丹麥ROSCO紙片擴(kuò)散法,紙片不同但檢測(cè)原理相似,即通過藥敏紙片抑菌環(huán)直徑大小判斷菌株對(duì)不同藥物的敏感性,操作相對(duì)簡(jiǎn)便,但不能直接測(cè)得最小抑菌濃度[8]。Etest方法則是將瓊脂擴(kuò)散法與MIC檢測(cè)相結(jié)合的方法,即將已包被不同藥物濃度的藥敏條貼在涂布了菌液的瓊脂平板上,孵育一定時(shí)間后能夠根據(jù)抑菌環(huán)大小直接讀取MIC值,因此Etest方法結(jié)合了紙片擴(kuò)散法操作方便、結(jié)果易讀取及可直接獲得MIC值的優(yōu)勢(shì)。既往有研究評(píng)估唑類藥物Etest法與微量肉湯稀釋法一致率,但不同研究結(jié)果存在差異[9-12]。在PFALLER等[9]評(píng)估的1 568株念珠菌研究中,結(jié)果顯示對(duì)于氟康唑,Etest法與CLSI微量肉湯稀釋法EA為96.4%,對(duì)于伏立康唑兩者的EA為98.1%,與本研究對(duì)比結(jié)果接近。也有研究比較歐洲EUCAST肉湯稀釋法與Etest法的一致率,發(fā)現(xiàn)伏立康唑一致率最高為86.6%,氟康唑86.6%,伊曲康唑最低70.7%[10],與本研究結(jié)果相符但總體一致率偏低。本研究?jī)煞N方法檢測(cè)氟康唑和伏立康唑的一致率較高,EA和CA均超過90%,但兩種檢測(cè)方法測(cè)得的伊曲康唑EA亦較低,主要原因是部分熱帶念珠菌和近平滑念珠菌Etest檢測(cè)結(jié)果低于微量肉湯稀釋法檢測(cè)結(jié)果,而光滑念珠菌部分菌株Etest檢測(cè)值高于微量肉湯稀釋法,導(dǎo)致一致率偏低。因此對(duì)于熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌,伊曲康唑Etest結(jié)果的判讀須謹(jǐn)慎,但因伊曲康唑并非治療深部念珠菌感染的首選藥物,因此對(duì)于臨床治療侵襲性念珠菌感染疾病影響不大[13]。另外,本研究未評(píng)估泊沙康唑,但既往有研究顯示泊沙康唑Etest結(jié)果與微量肉湯稀釋法的CA為93%[14]。本研究存在一定局限性,首先克柔念珠菌數(shù)量偏少,并且本研究并未覆蓋其他少見菌種,因此研究結(jié)論無法代表全部念珠菌屬。另外,CLSI M60僅規(guī)定了部分念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的臨床折點(diǎn),而伊曲康唑無臨床折點(diǎn),本研究主要參考CLSI M59規(guī)定的伊曲康唑流行病學(xué)折點(diǎn)進(jìn)行分析,因此兩種方法統(tǒng)計(jì)得出的伊曲康唑CA僅供參考。但基于本研究綜合考慮,Etest法與微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類藥物敏感性一致率較高,藥敏結(jié)果易于讀取,是適于在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)唑類藥物敏感性的方法。

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