孔梅，戚宇紅，張晶，支雪榮

(1烏魯木齊友愛醫(yī)院，烏魯木齊830017；2新疆維吾爾自治區(qū)婦幼保健院)

近年來，國內(nèi)臨床胚胎停止發(fā)育的發(fā)生率呈逐年上升趨勢。該病發(fā)機制非常復雜[1]，其中葉酸缺乏和葉酸代謝相關(guān)基因缺陷是胚胎發(fā)育異常的重要誘導因素[2]。葉酸又名維生素B9，是機體必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，因自身無法合成，需通過腸道外途徑吸收[3]。葉酸以5-甲基四氫葉酸的形式存在于血漿中，并通過合成嘌呤和胸腺嘧啶來參與核酸、蛋白質(zhì)和磷脂的代謝，因為不能被直接利用，故必須通過一系列代謝酶的催化來實現(xiàn)其生理活性[4]。因此，參與體內(nèi)葉酸代謝的酶如亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)、還原葉酸載體(RFC-1)及蛋氨酸合酶(MTR)等基因的多態(tài)性與胎兒的生長發(fā)育緊密相關(guān)[5,6]。為此，本研究就葉酸代謝酶的基因多態(tài)性與胚胎停止發(fā)育的關(guān)系進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年3月～2018年6月在本院就診經(jīng)B超確認有胚胎停止發(fā)育史的婦女(胚胎停育組)114例，年齡(31.256±3.918)歲，體質(zhì)量(63.417±3.729)kg，產(chǎn)次(1.424±0.217)次，孕周(8.731±2.246)周。胚胎停止發(fā)育診斷標準：頭臀長度≥7 mm，孕囊平均直徑≥25 mm，無心跳。排除標準：宮腔畸形或?qū)m腔內(nèi)環(huán)境感染，夫妻雙方有家族性遺傳疾病，有化學或化工藥物接觸史，有心、肝、腎等重要臟器疾病等。隨機抽取同期有一次正常生育史、無不良妊娠史的婦女125例(對照組)，年齡(33.426±2.741)歲，體質(zhì)量(62.389±2.915)kg，產(chǎn)次(1.265±0.108)次，孕周(8.425±1.537)周。兩組臨床資料比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0,05)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準實施，入組女性均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 葉酸代謝酶基因多態(tài)性檢測 抽取受試者外周血5 mL存于真空抗凝試管中，5 000 r/min 4 ℃離心20 min，收集中層白細胞，-20 ℃保存。采用基因組DNA提取試劑盒獲取基因組DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀鑒定純度和濃度，OD260/OD280介于1.8～2.0，保存于-20 ℃。采用RCP-RFLP法檢測MTHFR C677T、MTRR A66G、RFC-1 A80G及MTR A2756G等位點葉酸代謝相關(guān)酶等位基因和基因型分布頻率，分析四個基因位點與胚胎停止發(fā)育的相關(guān)性。選擇各位點相應PCR-RFLP擴增引物序列，提取獲得的基因組DNA完成純度鑒定后進行PCR擴增，PCR擴增所用體系共計10 μL，包括1 μL的基因組DNA模板(30 ng/μL)，5 μL的2×Master Mix，0.5 μL的20×引物以及3.5 μL純水。以95 ℃預變性5 min后，95 ℃變性30 s，然后59 ℃退火30 s，最后72 ℃延伸60 s，40個循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸5 min。擴增后PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 葉酸利用能力等級判定 參照Li等[7]研究，葉酸利用能力風險等級的判定是以MTHFR C677T TT、MTRR A66G、RFC-1 A80G、MTR A2756G等位點GG型的出現(xiàn)頻率為指標，分為四個風險等級：突變純合型分布頻率<10.0%時可認為機體葉酸利用能力正常，劃分為未發(fā)現(xiàn)風險等級；突變純合型的分布頻率為11.0%～35.0%時為低風險；突變純合型分布頻率在36.0%～65.0%時為中度風險；而≥66.0%可判定為高風險。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗進行組間比較，Logistic回歸分析用于判斷各位點與胚胎停止發(fā)育的相關(guān)性。數(shù)據(jù)均通過Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MTHFR、MTRR、RFC-1及MTR等位基因分布情況 RFC-1 A80G、 MTR A2756G、MTRR A66G基因中A和G等位基因頻率在胚胎停育組和對照組間無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。而胚胎停育組中MTHFR基因C677T位點T等位基因的頻率分布在胚胎停育組和對照組中有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 兩組等位基因頻率分布比較(%)

2.2 兩組 MTHFR、MTRR、RFC-1及MTR的基因型頻率分布情況 胚胎停育組中MTHFR基因C677T位點TT突變純合型、MTRR基因的A66G位點的GG突變純合型頻率均高于對照組(P均<0.05)。RFC-1基因A80G位點以及MTR基因A2756G位點AA、AG和GG型的頻率在胚胎停育組和對照組間無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。見表2。

2.3 葉酸代謝酶基因多態(tài)性與胚胎停育的關(guān)系Logistic分析結(jié)果顯示，MTHFR C677T位點的突變純合型TT型與胚胎停止發(fā)育相關(guān)，其胚胎停育的風險高于CC型和CT型 (P均<0.05)，MTHFR C677T TT基因型是發(fā)生胚胎停育的危險因素。MTRR A66G GG基因型與胚胎停止發(fā)育的風險同樣高于AA、AG基因型(P均<0.05)，攜帶GG基因型是發(fā)生胚胎停育的危險因素。RFC-1 A80G、MTR A2756G的位點突變與胚胎停育的風險無關(guān)。見表3。

表2 兩組基因型頻率分布比較[ 例(%)]

表3 葉酸代謝酶基因多態(tài)性與胚胎停育的Logistic分析結(jié)果

2.4 兩組葉酸利用能力比較 胚胎停育組中葉酸利用能力在未發(fā)現(xiàn)風險、低度風險分布比例分別為3.51%和14.91%，低于對照組的31.20%和45.60%(P均<0.05)。而胚胎停育組在中度風險和高度風險的分布比例分別為49.12%和32.46%，高于對照組14.40%和8.80%(P均<0.05)。

3 討論

由葉酸代謝酶基因突變引起酶活性降低，可能導致同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化受阻，引起S-腺苷甲硫氨酸水平降低，抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性從而影響DNA甲基化，誘發(fā)胚胎停止發(fā)育、早產(chǎn)、妊娠期高血壓等產(chǎn)科疾病[8,9]，葉酸代謝酶基因突變可能與胚胎停止發(fā)育發(fā)生有關(guān)。MTHFR、MTRR、RFC-1和MTR是目前與臨床產(chǎn)科診斷相關(guān)的葉酸代謝酶，本研究通過探究這4種基因多態(tài)性與胚胎停止發(fā)育的相關(guān)性，以希望對存在潛在胚胎停止發(fā)育患者的診斷有所幫助。

MTHFR基因突變類型有20余種，其中最具臨床意義的突變位點是C677T突變。突變表現(xiàn)為三種基因型，即野生純合型CC、突變雜合型CT和突變純合型TT型；突變后MTHFR酶活性降低，降低程度與基因型有關(guān)，其中突變雜合型CT型活性降低30%左右，突變純合型TT型的活性甚至降低60%以上[10, 11]。本研究等位基因頻率分布結(jié)果顯示，MTHFR C677T位點中T等位基因在胚胎停育組中的分布與對照組存在差異。而基因型頻率分析結(jié)果顯示，在胚胎停育組中MTHFR基因C677T位點TT突變純合型頻率高于對照組。這提示MTHFR C677T TT型頻率增加與胚胎停止發(fā)育有關(guān)。MTRR是同型半胱氨酸再甲基化途徑中的重要酶，在甲硫氨酸代謝途徑中起重要作用，作為甲基供體幫助維持機體蛋氨酸、四氫葉酸水平，減少同型半胱氨酸的蓄積毒性[12]。MTRR主要突變類型有A66G、S175L等，其中A66G突變是目前最主要也是研究最多的突變。該位點突變后使得蛋氨酸被異亮氨酸代替，酶活性降低，進而影響同行半胱氨酸代謝。突變所表現(xiàn)的三種基因型中，MTRR 66AA酶活性最高，其次是66AG，66GG活性最低[13]。本研究結(jié)果顯示，胚胎停育組MTRR A66G位點A、G等位基因所占比例與對照組相比無差異。但胚胎停育組MTRR基因A66G位點GG型的頻率高于對照組。這提示MTRR A66G GG型頻率的增加與胚胎停止發(fā)育有關(guān)。Logistic分析結(jié)果顯示，攜帶MTHFR基因TT突變純合型、MTRR A66G GG型是胚胎停止發(fā)育的危險因素。RFC-1酶通過協(xié)助5-甲基四氫葉酸進入胞內(nèi)來幫助核酸、蛋白質(zhì)和磷脂的合成，所以RFC-1基因突變的發(fā)生通過影響葉酸轉(zhuǎn)運增加胎兒宮內(nèi)發(fā)育缺陷的風險[14,15]。MTR是同型半胱氨酸蛋白酶的再甲基化的重要催化酶，該基因的突變通過阻礙再甲基化導致同型半胱氨酸蓄積，進一步引發(fā)胎盤血栓栓塞，而血栓栓塞的發(fā)生極易引發(fā)胎盤停止發(fā)育[16]。本研究發(fā)現(xiàn)RFC-1 A80G位點和MTR A2756G位點AA型、AG型和GG型頻率在胚胎停育組和對照組分布無統(tǒng)計學差異。即RFC-1基因的A80G位點和MTR基因的A2756G位點的突變純合型基因頻率的增加與胚胎停止發(fā)育無關(guān)，這個結(jié)果也通過進一步的Logistic分析得到確證。

綜上所述， MTHFR C677T位點和MTRR A66G位點與胚胎停止發(fā)育相關(guān)，對有MTHFR C677T位點和MTRR A66G位點基因突變孕產(chǎn)婦應積極進行干預，以預防和減少胚胎停止發(fā)育情況的發(fā)生。