馬葉婷，高文偉，周芃來，劉 卿，馬海利，張 鼎

(山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山西 太谷030801)

龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii,T.gondii)是引起人獸共患弓形蟲病的專性胞內寄生原蟲,幾乎能感染所有的溫血動物[1-2]。全球約有三分之一的人口感染弓形蟲,我國平均人群弓形蟲感染率為7.88%[3-4]。感染弓形蟲后,雖然免疫功能正常的人無明顯癥狀,但是免疫功能低下者會遭受嚴重的傷害甚至死亡[5]。例如,孕婦感染弓形蟲后,可導致流產(chǎn)、死胎及嬰幼兒的先天性弓形蟲病[6]；兒童感染弓形蟲后,一般表現(xiàn)為雙眼失明、視網(wǎng)膜脈絡膜炎及急性腦炎等。同時,弓形蟲的感染也會增加罹患精神分裂癥的風險,是精神分裂癥的致病因素之一[7]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上,弓形蟲可導致懷孕家畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎,嚴重時甚至導致動物死亡,增加動物的患病率、死亡率和治療成本,給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[8]。另外,弓形蟲感染在導致肉、奶、蛋、毛等產(chǎn)品質量、產(chǎn)量下降,即對養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失的同時,污染的動物食品和制品等也會隨著人類的消費將蟲體傳播給人類。鑒于此,弓形蟲病的防控及病原研究在公共衛(wèi)生和畜牧生產(chǎn)上均具有重要意義。

弓形蟲感染宿主細胞離不開其分泌的微線體蛋白(Microneme proteins, MICs)、棒狀體蛋白(Rhoptry proteins,ROPs)和致密顆粒蛋白(Dense granule antigens,GRAs)等[9]。這些效應因子在蟲體粘附、入侵、宿主細胞內增殖和逸出等過程發(fā)揮著重要的作用[10-13]。通過數(shù)量性狀遺傳位點等分析手段發(fā)現(xiàn),其中一些效應因子具有多態(tài)性,是決定不同基因型弓形蟲毒力差異的重要因素。目前鑒定出的弓形蟲多態(tài)性蛋白有ROP5、ROP16、ROP18、GRA2 和GRA15 等。目前已有較多關于對弓形蟲RH、GT1 和PRU 蟲株GRA15 蛋白功能的比較分析的報道[14-15]。本文就弓形蟲GRA15蛋白的結構、在蟲體與宿主互作中的作用、免疫保護性等方面的研究進展進行綜述,為深入研究弓形蟲不同基因型蟲株的致病分子機制提供背景資料。

1 GRA15 蛋白結構特點

ToxoDB 數(shù)據(jù)庫(http://toxodb.org/toxo/)及相關研究顯示,弓形蟲多態(tài)性GRA15 蛋白氨基酸序列長度有4 種,分別為278 aa、312 aa、550 aa 及635 aa(見表1)。I 型蟲株GRA15 蛋白多態(tài)性豐富,其不同蟲株GRA15 蛋白氨基酸序列長度包括以上278 aa、312 aa、550 aa 及635 aa 4 種(見表1)。由于編碼時存在移碼,I 型RH-ERP 蟲株和RH-JSR 蟲株的GRA15 基因分別編碼312 和278 個氨基酸[15]；其他I 型蟲株GRA15 基因分別編碼550 或635 個氨基酸[16]。II 型蟲株GRA15 基因編碼550 個氨基酸,III 型蟲株GRA15 基因編碼635 個氨基酸。長度為550 aa 的GRA15 蛋白比長度為635 aa 的GRA15 蛋白缺失85 個氨基酸,其中84 個位于C端,1 個位于N 端。另外,還有5 個位點的氨基酸不同(見表1)。

表1 弓形蟲不同基因型蟲株的GRA15 蛋白的結構特點

對II 型蟲株GRA15 蛋白的結構進行分析,結果顯示,其有一個跨膜區(qū)和一個PEXEL 樣的motif。PEXEL 樣的motif 在瘧原蟲上可作為分選信號指導蟲體蛋白進入宿主的紅細胞。相反,PEXEL 樣的motif 在弓形蟲上不是指導蟲體蛋白進入宿主細胞,而是能夠增強蛋白定位到納蟲囊泡膜上的能力[17]。據(jù)報道,II 型PRU 蟲株GRA15 蛋白可以定位到宿主細胞核內,這說明弓形蟲PRU 蟲株很可能存在剪切GRA15 蛋白PEXEL 樣的motif 的機制[18]。

2 GRA15 蛋白對宿主細胞的影響

2.1 對NF-κB 細胞信號通路的影響 Rosowski等[14]對北美及歐洲流行的RH-ERP 強毒株和PRU弱毒株GRA15 蛋白功能進行了比較分析,發(fā)現(xiàn)PRU弱毒株GRA15 蛋白在蟲體對宿主細胞調節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用,即能夠高水平引起宿主細胞NF-κB 信號通路的激活。激活機制很可能是,首先PRU 蟲株的GRA15 蛋白跟IKK-β 或TRAF6 形成復合體,引起IκB 的磷酸化和降解；之后引起p50 和p65 或c-Rel/p50 二聚體向細胞核內轉移,最終影響了一系列的與免疫、凋亡及炎癥相關的基因的轉錄和翻譯[19]。

PRU 蟲株的GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路引起的變化包括導致宿主細胞分泌IL-12,IL-12 又會刺激自然殺傷細胞和T 淋巴細胞分泌IFN-γ,從而使宿主能更好的抵抗弓形蟲感染；另外,GRA15蛋白激活宿主的NF-κB 信號通路后,引起單核細胞分泌IL-1β,而IL-1β 是調節(jié)炎癥極其重要的分子[20]。PRU 蟲株的GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路可以使巨噬細胞向M1 方向極化,而將此巨噬細胞給小鼠接種后能夠明顯降低血吸蟲感染引起的肝纖維化[21],這提示,PRU 蟲株的GRA15 蛋白可作為潛在的治療肝纖維化藥物；而將此巨噬細胞給小鼠接種后還能夠明顯抑制體內腫瘤的生長,這提示,PRU 蟲株GRA15 蛋白有作為新的治療手段來增強宿主免疫力并抵抗腫瘤的潛力[22]。據(jù)報道,PRU 蟲株的GRA15 蛋白還能夠增強宿主對蟲體的抵抗力和減輕腸道中由弓形蟲感染引起的炎癥[23]。

然而,與PRU 蟲株GRA15 蛋白相比,RH-ERP強毒株GRA15 蛋白僅具有微弱激活宿主NF-κB信號通路的作用,并且采用NF-κB 熒光素酶報告系統(tǒng)對該種程度的激活作用進行檢測時,檢測不到酶活力[15]。這是由于RH-ERP 蟲株GRA15 蛋白編碼時移碼,是非功能性蛋白。基于RH-ERP蟲株以上遺傳背景,Yang 等[15]將GRA15GT1基因導入RH-ERP 蟲株構建RH-ERP+GRA15 GT1 互補株并感染NF-κB 信號報告細胞,結果表明,RH-ERP+GRA15GT1互補株能夠明顯引起NF-κB 報告基因表達,這說明GRA15 GT1 蛋白能夠高水平激活宿主NF-κB 信號通路。盡管GT1 強毒株感染細胞后能夠引起NF-κB 信號通路改變,但是其激活NF-κB信號通路作用比PRU 弱毒株弱2 ～3 倍。一種可能是GRA15GT1蛋白受到GT1 蟲株其他基因的抑制作用,導致功能減弱。另一種可能是GRA15GT1蛋白比GRA15PRU蛋白多了85 個氨基酸和5 個位點的氨基酸存在不同導致的。相關研究表明,弓形蟲GT1 蟲株GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路的結構域為第194 ～518 氨基酸殘基[19]。 另外,Wei 等[24]將 弓 形 蟲 Ctwh3 蟲 株 的 GRA15(GRA15Ctwh3)蛋白轉染絨毛膜癌JEG-3 細胞發(fā)現(xiàn),GRA15Ctwh3蛋白可通過觸發(fā)內質網(wǎng)應激引起細胞凋亡。

2.2 對宿主其他方面的影響 PRU 蟲株GRA15 蛋白還能招募p65 鳥苷酸結合蛋白1(GBP1)聚集于納蟲囊泡膜上,破壞納蟲囊泡從而殺滅弓形蟲。這種招募機制不依賴于GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路,因為GBP1 蛋白是在感染后1 小時聚集,而GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路發(fā)生在感染后4小時[25]。

3 與GRA15 蛋白互作的宿主蛋白

通過酵母雙雜交技術發(fā)現(xiàn),PRU 蟲株GRA15蛋白能夠與小鼠Luzp1 蛋白互作[26]。 而小鼠Luzp1 蛋白具有3 個核定位序列且能夠作為Two-A-containing histone acetyltransferase(ATAC)和Mediator complex(MED)的橋梁分子,從而形成穩(wěn)定的Meta-coactivator complex(MECO)復合體,該復合體是一些非編碼RNA 的調節(jié)因子[27-28]。這很可能表明弓形蟲PRU 蟲株通過借助GRA15 蛋白與宿主Luzp1 蛋白的相互作用定位到細胞核。另外,也不排除PRU 蟲株的GRA15PRU蛋白通過與宿主Luzp1 蛋白的相互作用,以干擾宿主的Luzp1 蛋白行使正常功能的可能性。另外,據(jù)報道,PRU 蟲株的GRA15 蛋白很可能跟IKK-β 或TRAF6 形成復合體[14]。

4 GRA15 的免疫保護作用

目前弓形蟲病的治療主要依賴化學藥物,但是存在耐藥性、藥物殘留及不能有效殺死細胞內的弓形蟲包囊等問題。因此,關于弓形蟲病的疫苗研究一直是科學家研究的熱點。目前弓形蟲僅有用于綿羊免疫接種的S48 弱毒蟲株疫苗Toxovax?[29]。近年來,弓形蟲的基因工程疫苗成為研究的熱點和焦點。Chen 等[30]將PRU 蟲株GRA15基因構建真核重組表達質粒pVAX-GRA15,對昆明種小鼠進行免疫保護試驗,結果顯示,PRU 蟲株GRA15 蛋白能夠引起較強的Th1 型免疫應答；與對照組比較,免疫小鼠的存活時間延長,腦包囊數(shù)量減少。李曼[31]將弓形蟲Chinese I 型Wh3 株的GRA15 構建真核重組表達載體WH3-GRA15-GFP,對BALB/c 小鼠進行免疫保護試驗,結果顯示,WH3 蟲株GRA15 蛋白不能有效誘發(fā)BALB/c 小鼠的體液免疫和細胞免疫。例如,實驗組與對照組比較IFN-γ 水平?jīng)]有明顯升高。但是從GRA15蛋白能夠激活NF-κB 信號通路的角度來說,GRA15 蛋白在宿主細胞內表達后會引起IFN-γ 水平升高。因此,弓形蟲GRA15 蛋白能否作為疫苗候選分子需要進一步的研究,比如增加接種的劑量和改變接種的部位等。另外,GT1 蟲株GRA15蛋白是否能夠作為疫苗候選分子也需要進行研究。

5 展望

弓形蟲GRA15 蛋白是具有多態(tài)性的重要的毒力因子。至今,關于其對宿主細胞信號通路的影響、在蟲體與宿主蛋白互作中的作用及功能的初步應用的研究較多。但是,研究的焦點集中在弓形蟲PRU 弱毒株GRA15 蛋白,而對弓形蟲強毒株GRA15 蛋白的研究相對較少,例如,GT1 蟲株。此外,弓形蟲PRU 弱毒株GRA15 蛋白是否真正的能應用于抗肝纖維化和抗癌,需要進一步的研究。今后,相信隨著對弓形蟲各蟲株GRA15 蛋白研究的全面深入,將會為防治弓形蟲病及其他疾病奠定堅實的理論基礎。