楊全中，張 煜，謝永生

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng)453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng)453000)

實(shí)驗(yàn)小鼠是屬于野生鼷鼠變種中鼠屬,是實(shí)驗(yàn)室主要的使用的模式動(dòng)物之一,在動(dòng)物傳染病、微生物、藥品等多種研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)小鼠常用的品種是昆明系小鼠,為科學(xué)研究工作提供可靠的支持[1-3]。動(dòng)物糞便中含有多種有害物質(zhì),成為了生物污染的重要來源之一,給人類的健康造成嚴(yán)重的威脅,成為公共衛(wèi)生問題[4]。相關(guān)研究表明了在每年我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)中產(chǎn)生的糞便總量為32.64×108t 以上,糞便中含有沙門菌、大腸桿菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等多種病原微生物,糞便處理不當(dāng),這些含有病原微生物的糞便流入環(huán)境中、水源中,造成嚴(yán)重的污染,同時(shí)也可以引起其他動(dòng)物的感染[5-7]。因此,在養(yǎng)殖過程中動(dòng)物糞便的處理,應(yīng)該引起重視。病原微生物的攜帶的致病性及耐藥性可以隨著消化道排泄的糞便中,這些病原微生物攜帶的致病性及耐藥性可以通過多種途徑轉(zhuǎn)移到人的體內(nèi),危害人類健康的[6-7]。因此,對實(shí)驗(yàn)小鼠糞便中致病性病原微生物分布與耐藥性具有重要的意義。

本試驗(yàn)從某市的實(shí)驗(yàn)小鼠養(yǎng)殖基地采集糞便樣品120 份中分離到大腸桿菌、沙門菌、志賀菌3 種病原菌,并對分離的病原菌進(jìn)行了致病性及耐藥性檢測與分析。為實(shí)驗(yàn)小鼠健康養(yǎng)殖及細(xì)菌病防治提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 從某市的實(shí)驗(yàn)小鼠養(yǎng)殖基地采集糞便樣品120 份,裝入含有無菌的PBS 的采集管中,經(jīng)過處理進(jìn)行病原菌檢測。

1.2 主要試劑 大腸桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、7%綿羊血培養(yǎng)基、XLD 培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯購自青島海博生物有限責(zé)任公司；ID32E 腸道菌鑒定試條、16 種常用的藥敏紙片,均購自杭州天和微生物試劑有限公司；DL-2 000 Marker,購自北京中科瑞泰生物公司、2×Taq Marker Mix,購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒,購自北京天根生物科技有限公司；常規(guī)的試劑和儀器由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 450 只體重22 g 左右的健康的昆明系小鼠由某市的實(shí)驗(yàn)小鼠養(yǎng)殖基地提供。

1.4 分離與鑒定 取無菌的PBS 的采集管中樣品,無菌分區(qū)接種于7%綿羊血培養(yǎng)基上,一個(gè)樣品一個(gè)區(qū),在37 ℃恒溫箱進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并挑取7%綿羊血培養(yǎng)基上單個(gè)優(yōu)勢菌落分別接種于S.S.培養(yǎng)基、XLD 培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基3 種培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng),挑取鑒別培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)后,進(jìn)行生化試驗(yàn)和染色鏡檢。

1.5 生化試驗(yàn)鑒定 按照ID32E 腸道菌鑒定試條說明書,用全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)對純化的菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

1.6 分離菌株P(guān)CR 的檢測與測序 參考文獻(xiàn)[8],根據(jù)大腸桿菌、沙門菌、志賀菌保守區(qū)基因序列設(shè)計(jì)特異引物23 Sr RNA 基因、invA 基因和志賀菌ipaH 基因(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按照試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA,以提取的分離菌株的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR 鑒定,并將分離菌株的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,分離菌株的測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中登錄參考株的基因序列進(jìn)行同源性比較。見表1。

表1 引物序列

1.7 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[9],進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)。將取純化培養(yǎng)的分離株培養(yǎng)至對數(shù)期進(jìn)行計(jì)數(shù),每株分離菌株灌胃攻毒5 只小鼠,劑量為0.25 mL(1×108CFU/mL),對照組給予等量的無菌的PBS。攻毒12 h 后觀察6 d 并記錄每組小鼠的死亡情況,并進(jìn)行病原菌鑒定。

1.8 藥敏試驗(yàn) 分離菌株的藥敏試驗(yàn)參照用美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B 紙片法進(jìn)行,按照CLSI 的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進(jìn)行結(jié)果判斷,分析耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 疑似沙門菌在S.S.瓊脂培養(yǎng)基長出了半透明,圓形的、個(gè)別的中間帶有黑色心的菌落,分離菌株革蘭染色為陰性、兩端略圓的小直桿狀。疑似志賀菌分離菌株在XLD 培養(yǎng)基上長出光半透明的、滑的、圓形、表面光滑的中等大小粉紅色或者無色的菌落。疑似大腸桿菌的分離菌株在大腸桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基長出濕潤的、圓形的、大小一致的淺綠色或者綠色的菌落,分離菌株革蘭染色為陰性,呈兩端鈍圓桿狀菌；分離菌株革蘭染色為陰性、呈兩端略圓的短桿狀。

2.2 生化鑒定結(jié)果 分離的30 株分離菌株均能發(fā)酵枸櫞酸鹽、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇；吲哚試驗(yàn)呈陰性,個(gè)別的菌株產(chǎn)生H2S,被鑒定為沙門菌,評定結(jié)果合格率為98.9%～100%；分離的25 株分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇,硝酸鹽試驗(yàn)、M.-R.試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均為陽性；尿素酶試驗(yàn)和V-P 試驗(yàn)陰性。被鑒定為志賀菌,評定結(jié)果合格率為98.9%～99.9%；分離的35 株均能分解甘露醇、葡萄糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,V-P 試驗(yàn)呈陰性、吲哚和甲基紅反應(yīng)為陽性,被鑒定為大腸桿菌,評定結(jié)果合格率為99.0%～100%；

2.3 PCR 檢測與測序結(jié)果 分離的30 株分離菌株用沙門菌invA 基因引物均擴(kuò)增出大約為184 bp 大小的目的條帶,分離的25 株分離菌用志賀菌ipaH基因引物均擴(kuò)增出大約為393 bp 大小的目的條帶,分離的35 株用大腸桿菌23 Sr RNA 基因引物均擴(kuò)增出大約為652 bp 大小的目的條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示,30 株分離菌株測序結(jié)果與GenBank 庫中登錄的沙門菌參考株基因序列同源性在98.9%～99.9%之間；25 株分離菌株測序結(jié)果與GenBank 庫中登錄的志賀菌參考株基因序列的同源性在97.9%～99.9%之間；35 株分離菌株測序結(jié)果與GenBank 庫中登錄的大腸桿菌參考株基因序列同源性99.0%～100.0%之間；因而證實(shí)了從采集的120份樣品中分離得到了30 株沙門菌、25 株志賀菌、35株大腸桿菌。

圖1 分離菌株P(guān)CR 鑒定結(jié)果

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果 在攻毒后的48 ～96 h,攻毒的不同的分離菌株小鼠出現(xiàn)不同程度的死亡,直到試驗(yàn)結(jié)束。從死亡的小鼠的肝臟內(nèi)分離到了沙門菌、志賀菌、大腸桿菌。對照組的小鼠健康存活,經(jīng)過統(tǒng)計(jì)與分析,24 株為致病性沙門菌、20 株為致病性志賀菌。25 株為致病性大腸桿菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果由表2 可知,分離的24株致病性沙門菌、大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、氨曲南、氟苯尼考、鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素、多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶10 種藥物耐藥性比較強(qiáng),耐藥性在50.0%～100.0%之間,對頭孢噻呋、頭孢曲松 大觀霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星6 種藥物相對較低,耐藥性在16.7%～37.5%之間；分離的20 株致病性志賀菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、大觀霉素、多西環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素10 種藥物耐藥性較高,耐藥率在65.0%～100%之間,對頭孢噻呋、頭孢曲松、氨曲南、林可霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星6 種藥物耐藥率在10.0%～35.0%之間；分離的25 株致病性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶9 種藥物耐藥性較高,耐藥率在60.0%～100.0%之間,頭孢噻呋、頭孢曲松、氨曲南、大觀霉素、萬古霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等8 種藥耐藥率在12.0%～48.0%之間。

表2 分離菌株耐藥性分析結(jié)果

3 討論

動(dòng)物糞中含有細(xì)菌、益生菌、噬菌體等多種微生物,糞便中所含的微生物具種類繁多復(fù)雜 呈現(xiàn)多樣性化分布、易污染環(huán)境等特點(diǎn),糞便中的一些致病性的病原微生物所攜帶致病因子和耐藥性可以通過多種途徑污染食品傳播給人類,給人類的健康帶來嚴(yán)重的威脅[10-11]。相關(guān)研究表明了致病性病原菌,如大腸桿菌、沙門菌、志賀菌、葡萄球菌等廣泛存在動(dòng)物糞便中,同時(shí)這些致病病原菌也是引起人們食物中毒的病原菌[13]。本試驗(yàn)從某市的實(shí)驗(yàn)小鼠養(yǎng)殖基地采集糞便樣品120 份中分離了25 株致病性大腸桿菌、24 株致病性沙門菌、20 株致病性志賀菌。說明了致病性大腸桿菌、致病性沙門菌、致病性志賀菌在某市的實(shí)驗(yàn)小鼠養(yǎng)殖基地的糞便中廣泛存在,應(yīng)引起重視。大腸桿菌、沙門菌、志賀菌為條件致病菌,當(dāng)外界條件改變時(shí),有可能引起實(shí)驗(yàn)小鼠發(fā)病,在實(shí)驗(yàn)小鼠養(yǎng)殖過程中應(yīng)該引起重視,勤換墊料、注意環(huán)境中的消毒。 李基棕等[14]研究表明了在貴州省養(yǎng)豬場中糞便樣品中分離到了4 種致病菌。文明等[15]研究表明了在豬糞便中分離到大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌3種病原菌。與本試驗(yàn)存在一定差異性,可能與宿主有關(guān)。

相關(guān)研究表明了從糞便中分離的沙門菌、大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌等多種致病菌具有很強(qiáng)的耐藥性,且出現(xiàn)多重耐藥性,這些致病菌的耐藥性可以通過環(huán)境、畜產(chǎn)品等途徑傳播給人類[13-16]。本試驗(yàn)研究表明,分離的24 株致病性沙門菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素等10 種藥物的耐藥率在50.0%以上,對其他藥物耐藥率在16.7%～37.5%之間；分離的20 株致病性志賀菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素等10 種藥物耐藥率在65.0%以上,對其他藥物的耐藥率在10.0% ～35.0%之間；分離的25 株致病性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素等9 種藥物耐藥率在60.0%以上,對其他藥物耐藥率在12.0% ～48.0%之間。說明了從實(shí)驗(yàn)小鼠糞便中分離的病原菌耐藥性嚴(yán)重,應(yīng)該引起重視。國內(nèi)關(guān)于豬糞便中分離的病原菌耐藥性報(bào)道較多,關(guān)于實(shí)驗(yàn)小鼠糞便中病原菌及耐藥性國內(nèi)未見報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。