王華南，衛(wèi)順生，高聰聰，馬 文，裴世敏，楊 旭，張 迪，金藝鵬，林德貴

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,浙江 杭州310058；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山西 太原030032；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀100193)

乳腺腫瘤是母犬最為常見的腫瘤,其發(fā)病率約占母犬全部腫瘤性疾病的25%～42%,因此在獸醫(yī)臨床上對(duì)犬乳腺腫瘤進(jìn)行明確診斷、治療和判斷預(yù)后是從事獸醫(yī)行業(yè)的人們不懈探索的目標(biāo)[1]。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中的類固醇激素與腫瘤的預(yù)后、化療耐藥性等密切相關(guān)[2]。

類固醇激素通過與ER、PR、AR、GR 等在內(nèi)的類固醇受體結(jié)合,進(jìn)而調(diào)控乳腺腫瘤的生長(zhǎng)[3]。類固醇激素與受體的結(jié)合則需要類固醇受體輔助活化因子-3(Steroid receptor activation factor 3,SRC-3)的調(diào)控,一旦SRC-3 異常表達(dá),會(huì)高度激活下游很多癌基因信號(hào)通路的激活,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。

SRC-3 最早在人乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn),與乳腺癌的發(fā)生、惡性程度及預(yù)后具有相關(guān)性[5、6]。還有研究表明,SRC-3 與卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生均密切相關(guān)[5,7-9],所以SRC-3 已成為導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的一個(gè)癌基因。而國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道SRC-3 在犬乳腺癌中的表達(dá)情況,因此本研究有助于我們更好地評(píng)價(jià)其對(duì)犬乳腺腫瘤的預(yù)后作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物材料 選取2011 年至2014 年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收集的犬乳腺腫瘤組織,根據(jù)WHO 的分類標(biāo)準(zhǔn),68 例犬組織分為28 例良性乳腺腫瘤、40 例惡性乳腺腫瘤(包括/例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)。無菌手術(shù)器械對(duì)腫瘤不同部位進(jìn)行取材,無菌生理鹽水沖洗后,用十倍體積的4%中性甲醛固定液固定。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人SRC-3 單克隆抗體工作液(Santa 公司)；克隆系C-10；DAB 顯色試劑盒和PV-9000 通用型二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；自動(dòng)脫水機(jī)、半自動(dòng)石蠟包埋機(jī)、手動(dòng)切片機(jī)、恒溫展片機(jī)(英國(guó)Shandon 公司)。

1.3 試驗(yàn)方法 對(duì)所有收集到的乳腺腫瘤組織進(jìn)行SRC-3 免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色方法參照文獻(xiàn)。簡(jiǎn)要步驟如下:將上述固定的乳腺組織用組織包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋；每個(gè)石蠟組織至少制備2 張3 μm 的切片；第一張切片制備H&E,進(jìn)行病理學(xué)分類；另一張組織切片經(jīng)過脫蠟、水化、修復(fù)抗原、封閉、加一抗、加二抗、顯色等過程完成SRC-3 的免疫組織化學(xué)染色。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及分析方法 SRC-3 表達(dá)以細(xì)胞核出現(xiàn)黃褐色為陽(yáng)性反應(yīng)。在400 倍顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。根據(jù)染色細(xì)胞占比例可分為5 級(jí)。0分:＜5%,1 分:5%～25%,2 分:26%～50%,3 分:51%～75%,4 分:＞75%。根據(jù)顯色程度判斷陽(yáng)性強(qiáng)度:標(biāo)本無著色為0 分；淡黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。 兩者分?jǐn)?shù)乘積0 ～2 分為(-)；3-4分為(+)；6 ～8 分為(++)；8 分以上為(+++)。“-”與“+”為低表達(dá),“++”與“+++”為高表達(dá)。每份切片計(jì)分=細(xì)胞染色數(shù)分?jǐn)?shù)×染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù),所得分?jǐn)?shù)＜1 為陰性結(jié)果,反之為陽(yáng)性。

采用SPSS 11.0 及PPMS 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)間比較采用卡方檢驗(yàn)和H 檢驗(yàn),相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。P ＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

如中插彩版圖1(A 和B)中所示,SRC-3 主要表達(dá)于細(xì)胞核,少部分在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。SRC-3 在41例乳腺癌中均有表達(dá),但表達(dá)的程度有較大差異。惡性乳腺腫瘤的表達(dá)率為77.5%高于其他類型的乳腺組織(35.7%),表達(dá)情況有一定差異(見表1)。

3 討論

SRC 家族是輔助激活因子的一類,目前已知的包括3 種:SRC-1、SRC-2、SRC-3。SRC-3 是最先在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的一種基因,它在很多的組織中都有表達(dá),但在乳腺和卵巢中的表達(dá)量最高[5]。它以配體依賴的形式與核受體相互作用,通過受體的甲基化反應(yīng)或乙?；磻?yīng)以及其他一些輔助因子的參與來提高核受體基因的轉(zhuǎn)錄活性[4]。SRC 蛋白家族主要對(duì)類固醇受體如雌激素受體、孕激素受體、甲狀腺素受體以及糖皮質(zhì)激素受體等發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育以及生殖具有重要的影響[4]。人類研究證實(shí),SRC-3 蛋白表達(dá)與肌層浸潤(rùn)深度具有明顯的相關(guān)性,說明過度表達(dá)的SRC-3 可能參與細(xì)胞的異常生長(zhǎng)增殖,對(duì)腫瘤的形成及其局部侵襲能力具有一定的促進(jìn)作用[10-11]。因此我們可以認(rèn)為,腫瘤組織中SRC-3 表達(dá)水平越高,其深肌層浸潤(rùn)的可能性越大,因?yàn)榧咏?rùn)深度是乳腺腫瘤預(yù)后不良的因素之一,可以結(jié)合其他預(yù)后不良的高危因素綜合判斷預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療。

表1 SRC-3 的表達(dá)情況

人類癌癥研究中發(fā)現(xiàn),SRC-3 蛋白在ER 陽(yáng)性的乳腺腫瘤中的表達(dá)量明顯地高于ER 陰性的乳腺腫瘤,說明雖然SRC-3 蛋白的異常表達(dá)能夠通過多種途徑導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,但在雌激素敏感的乳癌腫瘤中,雌激素受體途徑應(yīng)該在腫瘤的癌變過程中發(fā)揮重要作用[12]。我們只研究了SRC-3 在犬乳腺腫瘤中的表達(dá)情況,并且SRC-3 主要在惡性乳腺癌中高表達(dá),主要表達(dá)于乳腺細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,而我們本次試驗(yàn)并未分析SRC-3 與ER 之間的關(guān)系,但并未我們將來研究SRC-3 與ER 所涉及的信號(hào)機(jī)制做了基礎(chǔ)工作。

SRC-3 在犬正常組織中無表達(dá),但是在腫瘤組織中有表達(dá),其中SRC-3 在部分惡性腫瘤表達(dá)明顯,適用于作為早期判斷惡性程度指標(biāo)及預(yù)后指標(biāo)；篩選出SRC-3 強(qiáng)表達(dá)的乳腺腫瘤組織對(duì)于后續(xù)的研究可能有一定的意義。