楊小蓉，嚴 石，許 磊，馬 良

(1.中牧實業(yè)股份有限公司,北京 豐臺100070；2.農業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室,北京 海淀100095；3.北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術研究中心,北京 海淀100095)

口蹄疫(Foot-and-Mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染的疫病,主要發(fā)生在牛、羊、豬等偶蹄動物,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A 類傳染病[1]。疫苗的質量是防控該疫病的重點,抗原含量則決定了疫苗免疫效力[2-4]。我國目前使用的口蹄疫疫苗主要是滅活疫苗,其安全性和有效性是防控口蹄疫的關鍵。口蹄疫滅活抗原的檢測目前主要依靠蔗糖密度梯度法定量病毒146S 檢測,通過146S 檢測的本質是完整病毒的相對物理含量[5]。但該方法操作過程繁瑣,操作時間太長,一次能檢測樣品數量有限,檢測效率不高?，F有的免疫學方法檢測口蹄疫病毒抗原含量,是針對抗原表位,若抗原位點組成有變化,使用該檢測方法可能有誤差。即病毒碎片的某些抗原表位只要存在就能被檢測出,因此,非完整病毒也能被計數。在動物免疫試驗中發(fā)現,某些抗原位點不完整對機體免疫水平刺激有限,產生的抗體水平甚至達不到保護效果[6]。建立快速、準確、操作簡單、批量操作的口蹄疫滅活病毒抗原定量檢測方法提高疫苗生產廠家對于疫苗質量的控制能力,對高效疫苗的研發(fā)具有重要意義。

本試驗采用病毒計數儀對口蹄疫滅活病毒粒子進行定量檢測,耗時短,只需10 min,準確性較高、受干擾因素少,對口蹄疫疫苗的產品質量控制提供了較好的方法儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 5 份口蹄疫滅活抗原,平均分為A、B 兩組,A 組用于病毒計數儀檢測,B 組用于蔗糖密度梯度146S 檢測,樣品均由中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物制藥廠提供；超速離心機,購自BECKMAN 公司；分光光度計,購自紫外可見尤尼柯(上海)儀器有限公司；ViroCyt 病毒計數儀和病毒計數染色試劑盒(Virus Counter Reagent Kit),均購自艾貝泰公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒計數儀檢測

1.2.1.1 病毒樣品染色 將A 組5 份滅活抗原樣品在室溫下用14 000 r/min 離心10 min,收集上清用于計數檢測；將20 μL 上清液加入到180 μL 的Sample Dilution Buffer 中；將Combo Dye 工作液混勻,加100 μL 到200 μL 上述樣品管中；將樣品管蓋子蓋上,徹底震蕩混勻；室溫放置30 min,避光染色；染色完的樣品在等待檢測過程中,保持避光。

1.2.1.2 病毒樣品檢測 打開病毒計數儀,進行自動清洗。依次完成ISW 液體管、CVF 液體管檢驗,待顯示“Passed”后,換上PVS 液體管；選擇“PVS”按鈕并顯示“Successful”后,即可進行滅活抗原樣品的檢測。再依次ISW 液體管、CVF 液體管檢驗并顯示“Passed”后,裝上待檢樣品,選擇“Start Analysis”按鈕,開始分析樣品,并顯示“Collecting Data”。

待檢測完成后,保存數據,卸下樣品管。再依次ISW 液體管、CVF 液體管檢驗并顯示“Passed”后,即可檢測第2 個樣品。直至第3 份樣品檢測完后,清洗管道并關機[4]。

1.2.2 口蹄疫滅活抗原146S 檢測 將B 組口蹄疫滅活抗原樣品,經反復凍融3 次后,置-20 ℃冰箱中,備用；以5 000 r/min 離心15 min,獲取上清夜,然后再20 000 r/min 高速離心30 min 后取上清夜；接著以100 000 r/min 超速離心2 h,將沉淀用少量PBS 溶解；在離心管中依次加入15%,25%,35%,45%蔗糖,加的時候用長針頭從底部往上加的；在超速離心管中加入第3 步所獲取的含抗原樣品,110 000 r/min 離心2.5 h,發(fā)現在25%附近有一條明亮的帶,用長針頭將不同部位的帶都吸取出來,分別收集到不同的瓶內；檢測用分光光度計測定各樣品病毒含量[5]。

2 結果與分析

2.1 病毒計數儀檢測結果 利用病毒計數儀對A組5 份口蹄疫滅活抗原每個樣品濃度的檢測均重復3 次,平均值分別是6.80×108、3.79×108、1.17×109、9.38×108VP/mL 和4.33×108VP/mL,其變異系數范圍為1.15%～3.57%,說明該方法成立,且結果可靠。

表1 病毒計數儀檢測結果

2.2 蔗糖密度梯度法定量病毒146S 檢測結果 利用蔗糖密度梯度法對B 組5 份口蹄疫滅活抗原每個樣品濃度的檢測均重復3 次,平均值分別是5.79×109、5.47×109、1.24×109、9.98×108VP/mL和4.42×108VP/mL,其變異系數范圍為1.48%～5.08%,說明該方法結果可靠。

表2 蔗糖密度梯度法定量病毒146S 檢測結果

3 討論

為了比較146S 方法和病毒計數儀方法檢測病毒含量的特點,選擇5 份口蹄疫滅活抗原平均分為A 組、B 組(來自同一批次樣品)進行平行檢測。對于A 組5 份口蹄疫滅活抗原樣品,病毒計數儀檢測結果平均值分別為6.80×108、3.79×108、1.17×109、9.38×108VP/mL 和4.33×108VP/mL。對于B 組5 份口蹄疫滅活抗原樣品,蔗糖密度梯度法檢測146S 結果平均值則為5.79×109、5.47×109、1.24×109、9.98×108VP/mL 和4.42×108VP/mL。該兩種方法都是為了檢測病毒完整粒子。B 組的檢測結果普遍比A 組高一些,均屬正常,這是由于方法原理不同造成的系統(tǒng)誤差。

蔗糖密度梯度法檢測146S 原理是,不同顆粒之間存在沉降系數差時,在離心力作用下,顆粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法,病毒完整粒子在特定的密度梯度區(qū)帶。在樣品存在雜蛋白的情況下,蔗糖密度梯度法的特定密度梯度區(qū)帶除了病毒完整粒子外,有可能存在雜蛋白,因此與病毒具有同樣沉降系數的雜蛋白也會計數為病毒粒子。因此蔗糖密度梯度法檢測口蹄疫146S 抗原,對儀器設備要求較高,操作繁瑣,耗時長,不能進行大批量檢測。如果樣品純化不夠、雜蛋白偏高,由于雜蛋白的影響,蔗糖密度梯度法檢測口蹄疫146S 抗原則存在檢測結果偏高的可能。

而病毒計數儀檢測原理是,核酸和病毒衣殼蛋白都同時被染色、并且同時通過計數孔的時候,就計數1 個病毒粒子。病毒計數儀檢測病毒不受雜蛋白影響,因此,結果也更準確。

在動物疫病的預防和治療中,總病毒顆粒的定量檢測對于病毒疫苗的生產和研究均十分重要,而病毒計數儀10 min 就能快速檢測到病毒的總濃度,優(yōu)勢明顯[6-7]。因此,病毒計數儀定量檢測病毒抗原耗時短、受干擾因素少、準確性較高,對口蹄疫疫苗的產品質量控制提供了一種可采用的方法。