郭時(shí)金，董 林，唐世云，徐倩倩，王艷萍，3，楊麗梅，付石軍，沈志強(qiáng)

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州256600；2.山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司,山東 濱州2566004；3.山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心,山東 濱州256600)

由大腸桿菌感染導(dǎo)致的畜禽流行性大腸桿菌病給畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重的威脅,已嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展,同時(shí),隨著養(yǎng)殖規(guī)模的發(fā)展壯大,以及綠色養(yǎng)殖和環(huán)保事業(yè)的發(fā)展,抗生素在養(yǎng)殖事業(yè)中的使用受到越來越多的限制,因此而生的中獸藥愈來愈受到青睞[1-3]。

中獸藥是中獸醫(yī)學(xué)防治疾病的重要手段,中獸藥的配伍與禁忌是提高臨床療效,保證中獸藥用藥安全的重要環(huán)節(jié)。中獸藥因具備有效成分多、無殘留、作用靶位多、作用范圍廣、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)成為新型抗菌藥物及抗菌藥物增效劑的篩選靶點(diǎn)之一。

紫花地丁為堇菜科堇菜屬多年生草本植物,可全草入藥。中醫(yī)記載,紫花地丁具有清熱解毒、涼血消腫之功效。其主要化學(xué)成分為黃酮和香豆素類化合物[1-4]。紫花地丁的提取物已被證明具有廣譜的抑菌活性[5-6]。蘆薈為百合科植物庫拉索蘆薈、好望角蘆薈或其他同屬近緣植物葉的汁液濃縮干燥物。具有清熱涼肝,健脾,通腸作用。金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花。連翹為木犀科植物連翹的干燥果實(shí)。具有清熱解毒,消腫散結(jié)的作用。

本試驗(yàn)以紫花地丁-蘆薈、紫花地丁-雙花連翹提取物兩個(gè)藥物對(duì)大腸桿菌的抑制為研究對(duì)象,通過微量棋盤法篩選最佳配比,達(dá)到合理用藥、節(jié)約用藥的目的,以期為中獸藥發(fā)展做出微薄貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 藥材 紫花地丁、蘆薈,均購自安國伊康藥業(yè)有限公司；雙花連翹提取物,購自四川恒瑞通達(dá)生物科技有限公司；0.5 麥?zhǔn)媳葷峁堋HB、MHA 培養(yǎng)基等,均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 菌株 大腸桿菌O2標(biāo)準(zhǔn)菌株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)教研室饋贈(zèng)。

1.3 儀器 ST16R 離心機(jī),美國ThermoFisher ST 16R；RE-52AAA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海嘉鵬科技有限公司；SH-B 95A 型循環(huán)水式多用真空泵,上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式小型離心機(jī),Sigma 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 藥物的提取及濃縮 稱取20 g 紫花地丁,加入0.8 L 水冷凝回流煮沸1 h,再加入0.4 L 水冷凝回流煮沸1 h,3 000 r/min 離心10 min,-0.1 Mpa濃縮至1 g/mL；稱取20 g 蘆薈,加入40 mL 加熱使溶解,3 000 r/min 離心10 min,-0.1 Mpa 濃縮至0.5 g/mL。

1.4.2 制備大腸桿菌菌液 將大腸桿菌O2菌株,挑取平板上的單菌落,接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置37 ℃培養(yǎng)箱中,過夜培養(yǎng),稀釋至每毫升含細(xì)菌1.5×105CFU。

1.4.3 紫花地丁、蘆薈、雙花連翹提取物最低抑菌濃度的檢測(cè) 以微量稀釋法(Microdilution)進(jìn)行:取U形底96 孔板,在第1 ～9 孔中每孔加入MHB 50 μL,第1 孔加入藥物原液50 μL,混合均勻后,依次倍比稀釋至第9 孔,自第9 孔中吸取50 μL 棄去。第10 孔加入MH 肉湯100 μL 作為空白對(duì)照,第11 孔加入藥物原液100 μL 作為藥物對(duì)照,第12 孔為菌液對(duì)照(加入MH 肉湯50 μL)；在第1 至9 孔和12 孔各加入以上制備好的菌液50 μL；加完液后蓋上蓋,振蕩混勻,置入墊有濕潤紗布的方形盤內(nèi),于36 ℃培養(yǎng)18 ～24 h 后,觀察結(jié)果。見表1。

表1 微量稀釋法藥物加入方法

1.4.4 紫花地丁-蘆薈、紫花地丁-雙花連翹提取物聯(lián)合抑菌效果的測(cè)定 微量棋盤稀釋法,基本方法同微量稀釋法。用滅菌后的96 孔微孔板,在第1 ～6 行沿X 軸方向(從左到右)每孔中依次加入:MHB,1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC 的紫花地丁藥液各25 μL,以同樣的方法在第A-F 列沿Y軸方向(從上到下)每孔中依次加入8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC 的蘆薈(雙花連翹提取物)提取物液、MHB 各25 μL,將兩藥混合均勻。然后加入制備好的菌液50 μL,使最終抗菌藥物濃度與計(jì)劃稀釋度相同,加液完畢,蓋上蓋,振蕩混勻,放入墊有濕紗布的方盤內(nèi),36 ℃培養(yǎng)18 ～24 h,觀察結(jié)果。棋盤稀釋法藥物加入方法按表2,并設(shè)立平行樣。兩種藥物組合后每孔的最終濃度則為原藥物濃度的1/4。加液完畢后放入36.5 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)18 h。

1.4.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 用消毒棉簽將U 型底96孔聚乙烯微孔板的每孔培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至MHA 平板,置于36.5 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)過夜,觀察細(xì)菌生長情況,如平板上有細(xì)菌生長,則為該孔為陽性,即藥物濃度達(dá)不到抑菌效果；如無細(xì)菌生長,則該孔為陰性,即藥物濃度達(dá)到抑菌效果。

2 結(jié)果

2.1 紫花地丁、蘆薈提取結(jié)果 紫花地丁、蘆薈的終濃度分別為1.0 g/mL、0.5 g/mL。

2.2 最低抑菌濃度(MIC)

2.2.1 單獨(dú)用藥時(shí)紫花地丁MIC 為1/4 原液,蘆薈MIC 為原液,雙花連翹MIC 為1/4 原液。

2.2.2 聯(lián)合抑菌效果 紫花地丁與蘆薈聯(lián)用時(shí),紫花地丁的MIC(聯(lián))=1/64 原液,蘆薈聯(lián)用時(shí)的MIC(聯(lián))=1/32 原液；紫花地丁與雙花連翹提取物聯(lián)用時(shí),紫花地丁的MIC 為1/16 原液,雙花連翹提取物的MIC(聯(lián))=1/4 原液。

表2 棋盤稀釋法藥物加入法

2.2.3 聯(lián)合抑菌FIC FIC(紫花地丁-蘆薈)=紫花地丁聯(lián)用時(shí)的MIC/紫花地丁單測(cè)時(shí)的MIC+蘆薈聯(lián)用時(shí)的MIC/蘆薈單用時(shí)的MIC=(1/64 原液)/(1/4 原液) +(1/32 原液)/(1 原液) =0.093 75 ＜0.5,二者表現(xiàn)為協(xié)同作用。

FIC(紫花地丁-雙花連翹提取物)=紫花地丁聯(lián)用時(shí)的MIC/紫花地丁單測(cè)時(shí)的MIC+雙花連翹聯(lián)用時(shí)的MIC/雙花連翹單用時(shí)的MIC=(1/16原液)/(1/4 原液)+(1/4 原液)/(1/4 原液)=1.25 ＞1,二者表現(xiàn)為無關(guān)作用。

3 結(jié)論

紫花地丁與蘆薈聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用；紫花地丁與雙花連翹提取物聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)為無關(guān)作用。

4 結(jié)果分析與討論

由于中藥成分復(fù)雜,不同中藥提取物抗菌活性不同,作用機(jī)理不同于抗生素,療效往往受中藥各成分間的協(xié)同和綜合作用影響[2-7]。

關(guān)于紫花地丁與蘆薈、紫花地丁與雙花連翹提取物這兩個(gè)藥物聯(lián)合抑菌試驗(yàn)均未見相關(guān)報(bào)道。由以上試驗(yàn)結(jié)果可知,紫花地丁單獨(dú)應(yīng)用時(shí),最低抑菌濃度為1/4 原液,蘆薈單獨(dú)用藥時(shí),抑菌濃度為原液,當(dāng)二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí),紫花地丁抑菌濃度為1/64 原液,蘆薈抑菌濃度為1/32 原液,FIC=0.093 75,表現(xiàn)為協(xié)同作用；雙花連翹提取物單用時(shí)的MIC 為1/4 原液,與紫花地丁聯(lián)用時(shí),最低抑菌濃度為1/16 原液,降為原來的1/4,紫花地丁的抑菌濃度不變,FIC=1.25 ＞1,表現(xiàn)為無關(guān)作用。

說明紫花地丁與蘆薈聯(lián)合應(yīng)用后,抑菌效果明顯增強(qiáng)；紫花地丁與雙花連翹提取物聯(lián)合應(yīng)用后,抑菌效果沒有明顯增強(qiáng),二者表現(xiàn)為無關(guān)作用,目前尚未見到紫花地丁和蘆薈或雙花連翹提取物聯(lián)合抑菌方面的報(bào)道,此研究結(jié)果為紫花地丁和蘆薈或雙花連翹提取物的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。