汪 晶1,3 楊忠輝2 彭毛才讓2 陳惟思1,3 索果佳2 黃一平1,3 曹 鵬1,3 項(xiàng)欠本

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.青海省海南藏族自治州藏醫(yī)院，青海 海南 813000；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028

藏族醫(yī)藥具有民族特色，是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分。藏藥秦紫消癖丸系青海省海南州藏醫(yī)院治療乳腺增生的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由秦艽花、塞北紫堇、冬葵葉、水柏枝等5味藥材組成，具有調(diào)補(bǔ)沖任、化痰軟堅(jiān)、祛瘀散結(jié)等功效，主要用于乳腺增生癥，癥見乳房疼痛及乳房腫塊[1]。該制劑傳統(tǒng)劑型為水泛丸，制備工藝繁瑣，周期長，且微生物限度難以控制[2-4]，而改進(jìn)后的濃縮丸將冬葵葉、水柏枝進(jìn)行水提取后與其他三味藥材細(xì)粉混勻，采用塑制法制丸，生產(chǎn)效率大大提高，服用量減小，為適應(yīng)中藥制劑制造規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，為了提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床療效及用藥安全，試驗(yàn)進(jìn)行秦紫消癖丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，分別采用顯微鑒別、薄層色譜鑒別、HPLC等方法對制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，以期為民族藥醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑的開發(fā)及質(zhì)量控制提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 LC高效液相色譜儀公司(四元泵、自動進(jìn)樣器、DAD檢測器、柱恒溫箱；美國安捷倫)；ZF-20C暗箱式紫外分析儀；AT 201型1/10 萬以及 XP6 型 1/100萬電子天平電子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-5200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；AK-55型流水式粉碎機(jī)、AW-96型臺式全自動制丸機(jī)(溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司)；Millipore型純水器(美國Millipore公司)；硅膠G、GF254薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 材料 龍膽苦苷對照品( 批號: 110770-201515，中國食品藥品檢定研究院)；獐牙菜苷對照品(批號：MUST-17073009，成都曼思特生物科技有限公司)；原阿片堿對照品(批號為: 110853-201404，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；水為超純水；其余試劑均為分析純。秦紫消癖丸樣品(批號：20170601、20170602、20170603，江蘇省中醫(yī)藥研究院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 取本品加少量水溶散后，過濾，濾渣再用水合氯醛加熱透化，稀甘油封片，鏡檢，記錄顯微特征。結(jié)果：花粉粒類圓球形，表面雕紋不明顯，直徑36 μm[5]，有3個萌發(fā)孔(秦艽花)。葉表皮細(xì)胞不規(guī)則形，垂周壁平直或彎曲，氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(塞北紫堇)。顯微特征如圖1。

2. 2 TLC鑒別

2.2.1 秦艽花 取藏藥秦紫消癖丸1.0 g，研細(xì)(過4號篩)，置于100 mL三角錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲處理30 min，將溶液搖勻，用濾紙濾過，制備成供試品溶液[6-8]；另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每 l mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方工藝制備得不含秦艽花丸劑，以相同方法制成陰性對照品溶液[9]。照《中國藥典》2015 年版四部通則0502薄層色譜法試驗(yàn)[10]，吸取對照品溶液1 μL，供試品溶液和對照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水( 20∶2∶1 )為展開劑，預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。由圖2可知，供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)位置上有顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾[11-13]。

2.2.2 塞北紫堇 取藏藥秦紫消癖丸5.0 g，研細(xì)(過4號篩)，置于三角錐形瓶中，加二氯甲烷-甲醇-濃氨試液 ( 5∶1∶0.1 )混合溶液40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[14-16]。另取原阿片堿對照品，加甲醇制成每l mL含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。按處方工藝制備得不含塞北紫堇丸劑，以相同方法制成陰性對照品溶液[17-18]。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液( 10∶8∶2∶0.3 )為展開劑，預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液[19]。供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)位置上有顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 采用X-Bridge C18色譜柱(250 ×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.4%甲酸水(22∶78)；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；采用DAD紫外檢測器檢測，檢測波長為245 nm；進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按龍膽苦苷計(jì)算，應(yīng)不低于4000[20-22]。

2.3.2 溶液制備 對照品溶液的制備：稱取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解，定容，即得0.4859 mg/mL龍膽苦苷貯備液。稱取獐牙菜苷對照品適量，精密稱定，甲醇溶解并定容至量瓶中，即得0.1339 mg/mL獐牙菜苷貯備液。分別精密吸取上述溶液5 mL于10 mL量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，即得含龍膽苦苷0.2429 mg/mL、獐牙菜苷0.0669 mg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：將丸劑研細(xì)，取約0.4 g，精密稱定，置三角錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取少量溶液于離心管中高速離心，上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

陰性對照溶液制備：按處方比例稱取除秦艽花以外的藥材，按本品制備工藝及供試品制備方法制成陰性對照溶液。

2.3.3 專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，龍膽苦苷及獐牙菜苷色譜峰在供試品、對照品溶液色譜圖中保留時間一致，陰性供試品在此處未有吸收峰，表明在上述HPLC測定條件下，無陰性干擾，建立的方法專屬性良好。結(jié)果見圖4。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液0.5、1、2、3、4 mL置于5 mL量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定。以對照品濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程分別為龍膽苦苷Y=11.787X+15.009(r=0.9997)、獐牙菜苷Y=17.073X-10.094(r=0.9997)，線性范圍分別24.295～194.360、6.695～53.560 μg·mL-1，結(jié)果表明線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述混合對照品溶液(含龍膽苦苷0.0972 mg/mL、獐芽菜苷0.0268 mg/mL)10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得龍膽苦苷與獐牙菜苷峰面積RSD分別為1.08%、1.70%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，研細(xì)，按供試品制備方法平行制備6份，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得龍膽苦苷、獐牙菜苷平均含量分別為6.0510，2.0307 mg/g，RSD分別為2.90% 、2.31%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣測定，測得龍膽苦苷、獐牙菜苷峰面積的RSD分別為2.28%、 2.57%，表明在室溫條件下，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定的樣品0.2 g，精密稱定，共6份，分別精密加入龍膽苦苷與獐牙菜苷混合對照品溶液(含龍膽苦苷0.2429 mg/mL、0.0669 mg/mL) 5 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備樣品，進(jìn)樣量為10 μL，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 秦紫消癖丸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.3.9 樣品含量測定 分別取3批秦紫消癖丸樣品，精密稱定，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算龍膽苦苷和獐芽菜苷含量，測定結(jié)果見表2。參考3批樣品含量測定結(jié)果，暫將樣品含量限度定為本品含龍膽苦苷不得低于5.4 mg/g，獐芽菜苷不得低于1.8 mg/g。

表2 秦紫消癖丸含量測定結(jié)果 /mg/g

3 討論

藏藥秦紫消癖丸是根據(jù)傳統(tǒng)藏醫(yī)藥理論，采用現(xiàn)代制劑技術(shù)將秦紫消癖丸制成濃縮丸，減小了服用量，提高了患者的依從性；降低微生物污染幾率；提高生產(chǎn)效率，促進(jìn)民族藥現(xiàn)代化的發(fā)展。

秦紫消癖丸中秦艽花的花粉粒、塞北紫堇的氣孔易檢出，其特征明顯，但專屬性較差，因此未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。在鑒別秦艽花的TLC試驗(yàn)中，以乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶1)、乙酸乙酯-甲醇-水(20∶2∶1)不同比例展開劑比較斑點(diǎn)分離情況后選擇分離效果更好的乙酸乙酯-甲醇-水(20∶2∶1)為展開條件；在鑒別塞北紫堇TLC試驗(yàn)中，比較不同展開系統(tǒng)環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(16∶3∶1)、正己烷-乙酸乙酯-三乙胺(16∶3∶2)、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶8∶2∶0.3)，確定了以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶8∶2∶0.3)為展開系統(tǒng)的分離效果最佳，選擇改良碘化鉍鉀試液為顯色劑，顯色清晰。在TLC鑒別試驗(yàn)中水柏枝與冬葵葉陰性有干擾，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

在HPLC含量測定時，通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷在245 nm和275 nm均有較大吸收，獐牙菜苷在245 nm處有最大吸收，且無陰性干擾，所以選擇245 nm處為檢測波長。供試品溶液制備過程中比較了回流提取與超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對秦艽花中龍膽苦苷的提取并無顯著性區(qū)別，考慮到超聲提取操作更加簡便，選擇超聲提取。提取溶劑比較了30%、50%、70%、100%濃度甲醇，發(fā)現(xiàn)30%、50%、100%濃度的甲醇提取的龍膽苦苷峰均拖尾，70%甲醇提取時龍膽苦苷峰形好，提取率更高，因此選擇70%甲醇為提取溶劑。比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.4%甲酸水等多種流動相體系，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.4%甲酸水為流動相洗脫時分離效果最好；本文的研究工作為秦紫消癖丸的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。