1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730000；

補腎強身片具補腎強身之功，君藥淫羊藿補腎壯陽，臣藥狗脊補肝腎、強腰膝，菟絲子補陽益陰、固精縮尿、明目止瀉，佐藥女貞子滋腎明目，金櫻子固精止遺[1-2]。原標(biāo)準(zhǔn)中有顯微鑒別，化學(xué)反應(yīng)及淫羊藿TLC鑒別，未見含量檢測；相關(guān)文獻(xiàn)[3-7]多數(shù)只有淫羊藿TLC鑒別和單一成分的含量測定；個別文獻(xiàn)[8-10]對該成藥中的化學(xué)成分做了定性分析，并對其中6種化學(xué)成分進(jìn)行了定量分析。經(jīng)驗證，原標(biāo)準(zhǔn)中淫羊藿TLC鑒別專屬性差，不能很好地重現(xiàn)，故改進(jìn)淫羊藿鑒別方法，同時新增菟絲子、金櫻子、女貞子的TLC鑒別，使其定性更準(zhǔn)確。其次，本研究選淫羊藿苷為替代對照品[11-12]同時測定處方中5個指標(biāo)成分的含量，以期在多組分含量測定過程中減少對照品的使用，為補腎強身片標(biāo)準(zhǔn)的制定提供更強有力的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Waters 2998(美國Waters)；不同色譜柱：Agilent 5 TC、SunFire TM、Capcell pak均柱為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；恒溫水浴鍋(常州國華電器，HH-6)；十萬分之一電子天平(MS205DU)、萬分之一電子天平(ME204)均為瑞士梅特勒公司；超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器，KQ-500DE)；薄層色譜成像儀(瑞士CAMAG，Visualizer 2)。

1.2 材料 對照藥材：淫羊藿(121032-200501)、菟絲子(121232-201102)、女貞子(121041-200703)、金櫻子(121047-200302)及對照品：淫羊藿苷(110737-201516，94.2%)、金絲桃苷(111521-201205，93.3%)、原兒茶酸(110809-200604)、綠原酸(110753-201716，99.3%)、朝藿定C(111780-201804，92.6%)均購于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G板(青島海洋化工)；磷酸(分析純)；實驗水(超純水)；甲醇、乙腈(進(jìn)口色譜純，99.9%)。補腎強身片(批號：1301、2301、3301、4301、5301、6301)及各藥材陰性樣品均由康縣獨一味生物制藥有限公司提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 淫羊藿TLC鑒別 ①樣品溶液的制備：各批次樣品約5 g，研細(xì)，25 mL乙醇水浴鍋回流半小時，放至常溫后過濾，蒸干濾液，加水35 mL少量多次溶解殘渣，先用乙醚萃取兩次(20 mL/次)去除色素，水層再用乙酸乙酯萃取兩次(25 mL/次)，棄去水層，蒸干，2 mL乙醇溶解殘渣，即得。②對照藥材溶液的制備：取1 g淫羊藿，同①項下處理，即得；另取適量淫羊藿苷，制成1 mg/mL的對照品溶液。③陰性樣品溶液的制備：取適量淫羊藿陰性粉末，同①項下處理，即得。吸取淫羊藿藥材5 μL，各批次樣品1 μL，淫羊藿苷3 μL，陰性樣品1 μL，點于G板上，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶2∶1∶1)展開[13]，晾干后噴1%AlCl3試液，105℃烘干，紫外光下觀看。TLC圖顯示，在和對照同一位置可見黃色斑點，陰性樣品沒有影響。如圖1所示。

2.1.2 菟絲子的TLC鑒別 ①樣品溶液制備：各批次樣品約5 g，研細(xì)，置于三角瓶中，加40 mL甲醇回流半小時，放至常溫后過濾，蒸干，加水35 mL少量多次將殘渣全部溶解，三氯甲烷萃取2次(20 mL/次)，三氯甲烷液蒸干，用1 mL三氯甲烷-無水乙醇(2∶3)混合液溶解殘渣，即得。②對照藥材溶液制備：菟絲子1 g， 30 mL甲醇回流半小時，放至常溫后過濾，濾液濃縮至1 mL，即得。③陰性樣品溶液的制備：取適量菟絲子陰性粉末，同①項下處理，即得。吸取菟絲子藥材4 μL，陰性溶液2 μL，各樣品溶液4 μL，點于G板上，用三氯甲烷-甲醇(20∶0.5)展開，晾干后噴磷鉬酸試液，110℃加熱顯色。TLC圖中，在菟絲子對照的對應(yīng)位置可看到同樣的綠色斑點(白光)，陰性樣品沒有影響。如圖2所示。

2.1.3 金櫻子的TLC鑒別 ①樣品溶液制備：各批次樣品約5 g，研細(xì)，置于三角瓶中，40 mL乙醇超聲半小時，濾過，蒸干，加水30 mL少量多次溶解殘渣，乙酸乙酯萃取兩次(25 mL/次)，棄去水液，蒸干， 2 mL甲醇溶解殘渣，即得[13]。②對照藥材溶液制備：取1 g金櫻子，同①方式提取，即得。③陰性樣品溶液的制備：取適量金櫻子陰性粉末，同①項下處理，即得。吸取陰性溶液1 μL，金櫻子藥材1 μL，各樣品溶液6 μL，點于硅膠G板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶0.2∶0.2∶0.5)展開，紫外光下觀察。TLC圖中，在金櫻子對照的對應(yīng)位置可看到同樣斑點，陰性樣品無影響。如圖3所示。

2.1.4 女貞子的TLC鑒別 ①樣品溶液：取金櫻子樣品溶液。②對照藥材溶液制備：取0.5 g女貞子，30 mL三氯甲烷超聲半小時，濾過，三氯甲烷液蒸干，2 mL甲醇溶解殘渣，即得[13]。③陰性樣品溶液的制備：取適量女貞子陰性粉末，同“2.1.3”項下①處理，即得。吸取陰性溶液1 μL，各樣品溶液6 μL，女貞子藥材6 μL，點于G板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5∶5∶1∶1)展開，噴10%硫酸乙醇，110℃加熱顯色。TLC圖中，在女貞子對照的對應(yīng)位置可看到同樣的紅褐色斑點，陰性樣品沒有影響。如圖4所示。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 流動相：乙腈(B)-0.5%磷酸(C)；梯度洗脫：0～8 min，6% B；8～15 min，6%～11% B；15～23 min，11%～18% B；23～27 min，18%～21% B；27～33 min，21%～27% B；33～47 min，27% B；47～48 min，27%～6% B；48～60 min，6% B；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；波長：270 nm。色譜圖如圖5所示。

2.2.2 對照溶液配制 用稱量舟分別精密稱取原兒茶酸16.30 mg， 21.51 mg，金絲桃苷18.96 mg，朝藿定C 20.31 mg，淫羊藿苷20.27 mg分別用甲醇定容至50 mL。另精密吸取原兒茶酸1 mL、綠原酸1 mL、金絲桃苷1 mL、朝藿定C 5 mL、淫羊藿苷4 mL于25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得濃度分別為0.01304 mg/mL、0.017087544 mg/mL、0.014151744 mg/mL、0.07522824 mg/mL、0.061101888 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 樣品溶液的制備 各批次樣品精密稱量1.0 g，置于三角瓶中，每批兩份平行樣，精密加25 mL稀乙醇，稱重，超聲1 h，冷卻后補足失重，混合均勻后靜置，取續(xù)濾液。

2.2.4 專屬性 取混合對照溶液10 μL、樣品溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示，在相應(yīng)保留時間，樣品和對照品相應(yīng)位置檢出色譜峰。如圖5所示。

2.2.5 線性關(guān)系 精密吸取5、7、9、10、11、13、15 μL混合對照品溶液進(jìn)樣測定?？v坐標(biāo)(Y)為峰面積，橫坐標(biāo)(X)為進(jìn)樣量，得線性關(guān)系，見表1；各指標(biāo)成分線性關(guān)系圖，如圖6～10所示。

表1 線性關(guān)系表

2.2.6 精密度 精密吸取10 μL混合對照品溶液，連進(jìn)6針，測得各成分平均峰面積：原兒茶酸298642(RSD=0.30%)、綠原酸165236(RSD=0.30%)、金絲桃苷290493(RSD=0.30%)、朝藿定C 1499789(RSD=0.40%)、淫羊藿苷1302262(RSD=2.80%)，說明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性 精密吸取10 μL樣品(批號：3301)溶液分別在0、4、8、12 h進(jìn)樣測定，測得各成分峰面積RSD：原兒茶酸0.05%、綠原酸1.37%、金絲桃苷1.25%、朝藿定2.20%、淫羊藿苷2.69%，說明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性 根據(jù)“2.2.3”方法取樣品(批號：3301)制備6份，按“2.2.1”項條件進(jìn)樣檢測峰面積，計算峰面積RSD：原兒茶酸2.25%、綠原酸0.97%、金絲桃苷1.67%、朝藿定0.17%、淫羊藿苷2.87%，說明該方法可行。

2.2.9 加樣回收率 精密稱取6份樣品(批號：3301)各0.5 g，研細(xì)，參照《中國藥典》2015年版四部9101指導(dǎo)原則[13]，根據(jù)各指標(biāo)成分含量，設(shè)置高、中、低濃度對照品加入量，使其與待測成分量之比控制在1.5∶1，1∶1，0.5∶1，按“2.2.3”項處理，進(jìn)樣測定各指標(biāo)成分峰面積并計算。結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果 (n=6)

續(xù)表2表2 回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.2.10 相對校正因子的計算[11]以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)物，計算淫羊藿苷相對于原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、朝藿定C的校正因子，根據(jù)不同色譜柱測得的相對校正因子，得出綜合校正因子，利用綜合校正因子間接計算原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、朝藿定C的含量，校正因子f值見表3。

2.2.11 含量測定 按“2.2.1”項下條件，分別測定各批次補腎強身片樣品，每個批次平行測定2次，計算含量；同時采用替代對照品法計算其余4個成分含量，結(jié)果見表4。

表3 校正因子f值

3 討論

淫羊藿提取過程中增加了乙醚萃取步驟，研究發(fā)現(xiàn)在本試驗中乙醚可有效去除淫羊藿藥材的色素，薄層顯色時使背景顏色降低，斑點更清晰可辨。金櫻子和女貞子共用同一個樣品提取液，調(diào)節(jié)展開劑比例即可將二者鑒別，簡化了樣品提取過程中的繁瑣步驟，節(jié)約了時間。進(jìn)行方法耐用性考察時，用不同廠家薄層板、不同溫度、不同濕度分別對其進(jìn)行展開，結(jié)果表明，不同板子、溫度、濕度對TLC鑒別無太大影響，本研究方法可用于補腎強身片中各藥材的定性鑒別。

按含量測定項下方法：①超聲:20、30、40、50、60、70和80 min；②功率：100%、70%、50%；③溶劑：無水乙醇、50%乙醇、甲醇。結(jié)果功率100%+超聲60 min+50%乙醇峰面積最大，因此選用該條件。相關(guān)文獻(xiàn)[9]報道，特女貞苷為女貞子活性成分，本研究方法中特女貞苷不易檢出，可能是梯度洗脫未能將特女貞苷分離出來，也可能是所選的提取溶劑和提取方法未將樣品中的特女貞苷提取完全，故本文未曾列出特女貞苷含量測定。本試驗曾嘗試梯度洗脫的同時采用切換波長的方法采集各指標(biāo)成分色譜峰，以期在各指標(biāo)成分波長最大吸收處測定其含量，試驗發(fā)現(xiàn)，切換波長會使樣品基線發(fā)生漂移，不利于各指標(biāo)成分含量測定，由于各指標(biāo)成分在270 nm處均有紫外吸收，故最終選擇單波長270 nm為其測定波長。

試驗選擇淫羊藿苷為替代對照品，利用相對校正因子同時測定5種成分含量；同時用不同色譜柱對校正因子進(jìn)行考察，條件允許的情況下建議使用不同的儀器、色譜柱、柱溫及檢測波長對其進(jìn)行進(jìn)一步考察，使相對校正因子更加準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)論

綜上所述，該試驗在中藥成方制劑的基礎(chǔ)上改進(jìn)了淫羊藿的薄層鑒別，同時新增菟絲子，女貞子，金櫻子的薄層鑒別，確保了鑒別工作的準(zhǔn)確性。由表4可看出，兩種方法所測定的指標(biāo)成分含量并無太大差別，說明替代對照品法可用于該中藥制劑的含量測定，為中成藥多指標(biāo)含量測定在節(jié)省對照品使用方面提供了新思路。