袁佳 張瑜 張著學(xué) 邱冬 倪婷婷 李馨 薛英波（通訊作者）

（貴州省人民醫(yī)院腫瘤科 貴州 貴陽 550002）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占原發(fā)性肺癌的80%，而其中70%的患者在診斷時(shí)就已經(jīng)是局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。含鉑兩藥化療可改善晚期NSCLC患者預(yù)后，但在過去十年中達(dá)到了平臺期[2]。NSCLC已進(jìn)入分子分型時(shí)代，根據(jù)不同的分子特征來選擇相應(yīng)的分子靶向藥物治療，患者的中位生存時(shí)間有望達(dá)到3.5年[3]。臨床觀察EGFR突變患者僅50%～80%對EGFR-TKIs治療有效，同時(shí)10%～20%EGFR野生型患者亦對EGFR-TKIs治療有效[4-6]。本研究旨在通過比較NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間EGFR基因突變狀況，探索二者之間是否存在不一致性，及這種異質(zhì)性對IRESSA療效的影響。

1.資料與方法

1.1 一般資料

入選標(biāo)準(zhǔn)：①2012年10月—2018年10月在貴州省人民醫(yī)院手術(shù)切除、纖維支氣管鏡活檢、穿刺活檢獲取原發(fā)病灶及轉(zhuǎn)移灶的晚期NSCLC患者；②相應(yīng)的原發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶有足夠多的癌組織可行EGFR基因突變檢測；③既往未接受過TKIs治療，現(xiàn)在計(jì)劃使用IRESSA治療；④患者年齡＞18歲。記錄病例的臨床病理資料，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理分型、腫瘤分化情況、術(shù)后的病理分期等。術(shù)后的病理分期根據(jù)AJCC2009年制定的NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定，腫瘤的分期與腫瘤發(fā)生時(shí)的診斷一致。吸煙史在患者第一次就診時(shí)獲得，吸煙狀態(tài)分為：①不吸煙者（一生中吸煙＜100支）；②曾經(jīng)吸煙者（術(shù)前12個(gè)月內(nèi)不再吸煙）；③現(xiàn)時(shí)吸煙者（術(shù)前12個(gè)月內(nèi)有吸煙并且≥100支。隨訪登記患者使用IRESSA后療效，每三個(gè)月復(fù)查一次胸部CT、腹部B超，每六個(gè)月復(fù)查一次頭顱MRI、全身骨掃描，直至疾病進(jìn)展。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有標(biāo)本均為10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，經(jīng)HE切片篩選出合適蠟塊，按照QIAampDNA提取試劑盒說明書逐步進(jìn)行，運(yùn)用分光光度計(jì)檢測DNA含量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因突變檢測 采用ADx-arms-EGFR突變檢測試劑盒（購自檢測標(biāo)本中EGFR基因不同情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0版本對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行EGFR基因突變率比較。采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行無進(jìn)展期生存率比較。檢驗(yàn)的顯著性水平為0.05（雙側(cè)）。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況

共收集NSCLC病例80例，中位年齡64歲（43歲～75歲），配對標(biāo)本80對，病理類型：腺癌64例（80%），鱗癌8例（10%），腺鱗癌8例（10%）。原發(fā)灶均為肺部病灶，其中52例為手術(shù)切除的肺部病灶，18例為纖維支氣管鏡活檢標(biāo)本，10例為經(jīng)皮肺穿刺活檢標(biāo)本。轉(zhuǎn)移灶中，縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶38例、皮下轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)8例、胸膜結(jié)節(jié)8例、鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例、腦轉(zhuǎn)移6例、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)4例、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例、肝轉(zhuǎn)移4例、骨轉(zhuǎn)移2例，見表1。

表1 患者一般情況

2.2 NSCLC患者原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀態(tài)

見表2。

表2 NSCLC患者原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀態(tài)基本情況分布

表3 NSCLC患者原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶EGFR基因突變情況與臨床病理特征之間的關(guān)系（例）

2.3 NSCLC患者原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶EGFR基因突變情況與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3.1 無論是在原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中，≤60歲的患者EGFR基因突變率均高于＞60歲的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.3.2 無論是在原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中，性別對于患者EGFR基因突變率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表3。

2.3.3 無論是在原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中，不同組織學(xué)類別之間患者EGFR基因突變率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表3。

2.3.4 無論是在原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中，無吸煙史患者EGFR基因突變率均高于有吸煙史患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.4 NSCLC患者原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀態(tài)一致性情況

見表4。

表4 NSCLC患者原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀態(tài)一致性情況

2.5 NSCLC患者靶向治療及聯(lián)合化療與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)EGFR基因檢測結(jié)果，對不論原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶存在EGFR突變的患者使用IRESSA治療，對二者均為野生型的患者進(jìn)行含鉑兩藥方案化療。通過Kaplan-Meier法分別比較兩組患者的無進(jìn)展生存期，靶向治療組患者中位無進(jìn)展生存期明顯高于聯(lián)合化療組（9.1月和4.8月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.369，P=0.000），見圖1。靶向治療組患者中，原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀態(tài)一致的患者中位無進(jìn)展生存期優(yōu)于原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀態(tài)存在異質(zhì)性的患者（13.5月和7.3月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.135，P=0.001），見圖2。

圖1 NSCLC患者靶向治療與聯(lián)合化療生存曲線比較

圖2 NSCLC靶向治療患者原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中EGFR基因狀態(tài)一致與不一致的患者生存曲線比較

3.討論

EGFR-TKI作用于EGFR胞內(nèi)段酪氨酸激酶區(qū)ATP結(jié)合域，當(dāng)癌細(xì)胞發(fā)生EGFR外顯子19和21突變激活時(shí)，可顯著提高局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的客觀緩解率，延長總生存期[6]。值得關(guān)注的是，不表達(dá)EGFR和部分EGFR野生型的NSCLC患者也可能從EGFR-TKI治療中獲益[7]。有研究者提出可能是由于EGFR突變或表達(dá)狀態(tài)的確定往往是通過原發(fā)灶手術(shù)切除或活檢獲得組織進(jìn)行分析，而大量的分子改變可能發(fā)生在轉(zhuǎn)移過程中。即原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間可能存在不同的EGFR基因狀態(tài)。研究顯示[8]，肺癌在分子水平上即便在同一腫瘤中也常常表現(xiàn)出異質(zhì)性，且在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中，EGFR突變、表達(dá)以及基因拷貝數(shù)往往也是不穩(wěn)定的，即轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)腫瘤的基因狀態(tài)往往不一致。

本研究從臨床實(shí)用角度出發(fā)，從兩個(gè)層次探討原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因異質(zhì)性導(dǎo)致的EGFR-TKIs療效差異：（1）NSCLC患者原發(fā)灶標(biāo)本及轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本的EGFR基因是否存在異質(zhì)性；（2）NSCLC患者原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因異質(zhì)性對IRESSA療效的影響。本研究中80例配對標(biāo)本中，采用ADx-arms-EGFR突變檢測試劑盒檢測肺原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶中EGFR基因突變狀態(tài)，結(jié)果顯示原發(fā)灶與相應(yīng)的轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因表達(dá)存在不一致性。入組病例中，原發(fā)灶10例存在EGFR19Del或L858R突變，而對應(yīng)的轉(zhuǎn)移灶6例為EGFR野生型、4例為L861QR突變；轉(zhuǎn)移灶6例存在EGFR19Del或L858R突變，而對應(yīng)的原發(fā)灶為EGFR野生型。不一致率為20%（16/80）。目前對于EGFR基因在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中突變的研究結(jié)果不盡相同，如王帥[9]等的研究中，在原發(fā)灶和腦轉(zhuǎn)移灶EGFR突變不一致率為16.1%（5/31），差異無顯著性。方勤[10]等的研究結(jié)果顯示35例原發(fā)NSCLC病灶與相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶配對標(biāo)本中11例標(biāo)本出現(xiàn)原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的EGFR基因表達(dá)存在不一致性，不一致率為31.43%（11/35），差異有顯著性。卿松[11]等報(bào)道NSCLC原則中總突變率為38.0%（19/50），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中總突變率為8.0%（7/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因可能與以下原因有關(guān)：（1）檢測方法不同；（2）入組病例數(shù)少；（3）獲取肺原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本時(shí)間存在差異等。本研究結(jié)果顯示不論在原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移灶中，EGFR基因在年齡≤60歲的患者及不吸煙者EGFR基因突變率均高于60歲以上患者及吸煙者，差異有顯著性，與文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]一致，顯示EGFR基因突變與吸煙呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示煙草中有害物質(zhì)作用靶點(diǎn)對EGFR基因突變有抑制作用。對TKIs療效觀察發(fā)現(xiàn)，原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶同時(shí)存在敏感性突變的患者使用TKIs治療無進(jìn)展生存期明顯優(yōu)于原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶同時(shí)為野生型者，有顯著差異，也優(yōu)于原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀態(tài)存在異質(zhì)性的患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因存在異質(zhì)性，在年齡≤60歲及不吸煙的患者中EGFR基因突變率較高。原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶同時(shí)存在敏感性突變的患者使用TKIs治療無進(jìn)展生存期明顯優(yōu)于原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因狀態(tài)存在異質(zhì)性的患者，為NSCLC患者個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。今后隨著對腫瘤異質(zhì)性的深入研究，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證其臨床效果。