郭井泉 王俊峰

【摘要】 目的：探究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)自噬相關(guān)通路在椎間盤(pán)退變大鼠中的作用。方法：選取SPF級(jí)3月齡大鼠120只，體質(zhì)量（300±50）g，制作腰椎不穩(wěn)定模型并切除卵巢會(huì)加速椎間盤(pán)的退變，分為4組：A組為假手術(shù)組（control）;B組為切除卵巢的模型組（model）;C組為切除卵巢并注射雌激素組（estrogen）;D組為切除卵巢并注射自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）組（3-MA）。使用HE染色和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠椎間盤(pán)退變程度及自噬程度，使用Westen Bolt檢測(cè)大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-A、p-mTOR、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3的表達(dá)量、凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)量，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：相比control組，model組和3-MA組大鼠椎間盤(pán)退變顯著加重，自噬程度顯著降低，VEGF-A、p-mTOR、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著升高，Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;相比model組，estrogen組大鼠鼠椎間盤(pán)退變顯著減輕，自噬程度顯著升高，VEGF-A、p-mTOR、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著降低，Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：大鼠椎間盤(pán)退變后會(huì)促進(jìn)血管生成因子表達(dá)增加，使得自噬水平顯著降低，其機(jī)制可能是退變過(guò)程中出現(xiàn)的新生血管化激活了mTOR信號(hào)通路并促進(jìn)細(xì)胞凋亡通路，抑制了椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】 椎間盤(pán)退變; 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子; 自噬; 凋亡

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.15.072 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2019）15-0-04

隨著我國(guó)人口老齡化和生活、工作方式的轉(zhuǎn)變，退變性腰椎疾病的發(fā)生率近年來(lái)不斷增高[1]。退變性腰椎疾病不僅會(huì)使得患者腰椎側(cè)凸畸形，同時(shí)也會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Zhang等[2]研究表明，脊柱退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中，椎間盤(pán)退變（intervertebral disc degeneration，IDD）發(fā)揮重要的始動(dòng)和核心作用。自噬（autophagy）是在正常生理?xiàng)l件下或存在應(yīng)激反應(yīng)，如生長(zhǎng)因子耗竭、氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)剝奪[3]。一定程度的自噬可以在細(xì)胞受到外界影響時(shí)起到保護(hù)作用，但過(guò)度自噬也可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這種死亡被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)細(xì)胞因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管形成的中心調(diào)控者，這種細(xì)胞因子在生理及病理性血管生成中發(fā)揮著重要的作用[4]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素耙蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路可能對(duì)細(xì)胞自噬有一定的抑制作用[5]。張軍等[6]研究表明，退變椎間盤(pán)組織中VEGF表達(dá)增加，會(huì)促使mTOR信號(hào)通路被激活，抑制了細(xì)胞自噬水平，促使椎間盤(pán)細(xì)胞向凋亡方向進(jìn)展，從而加速了椎間盤(pán)退變的發(fā)生。本文旨在研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)自噬相關(guān)通路在椎間盤(pán)退變大鼠中的作用，以期了解血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)自噬相關(guān)通路在椎間盤(pán)退變大鼠中的作用和機(jī)理，從而為椎間盤(pán)退變的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)3月齡雌性大鼠120只，體質(zhì)量（300±50）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2017-0022，普通級(jí)，分12個(gè)籠子飼養(yǎng)，每個(gè)籠子10只。飼養(yǎng)于筆者所在醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物與試劑

胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;磷酸緩沖液PBS購(gòu)自天津科密歐有限公司;caspase-3、caspase-9抗體購(gòu)于上海安研有限公司;LC3、Beclin-1抗體購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司;VEGF-A、mTOR抗體購(gòu)自默克有限公司;苯甲酸雌二醇注射液購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020529，規(guī)格1 ml：1 mg;自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）購(gòu)自sigma公司。

1.3 儀器

全自動(dòng)組織脫水機(jī)購(gòu)自德國(guó)SLEE公司;低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司;光學(xué)顯微鏡購(gòu)自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司;電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器上海有限公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自Thermo Fisher公司。

2 方法

2.1 建立模型

建立腰椎不穩(wěn)定模型，切開(kāi)大鼠胸部顯露胸椎下段、腰椎和骶骨上段，使用消毒后的手術(shù)刀切除全部腰椎棘突、棘上韌帶、棘間韌帶金腰段和兩側(cè)腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的后外1/2，縫合深筋膜和皮膚，不縫合豎脊肌，另外A組大鼠僅切開(kāi)皮膚后即縫合，作為假手術(shù)對(duì)照。根據(jù)劉光源等[7]研究表明，雌性大鼠切除卵巢后會(huì)加速椎間盤(pán)的退變。使用1%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉，注射劑量為40 mg/kg，后固定大鼠，在無(wú)菌條件下經(jīng)腹側(cè)入路切除雙側(cè)卵巢。

2.2 3-MA儲(chǔ)存液的配制

利用1×無(wú)菌PBS溶解3-MA粉末，配制成15 mmol/L的儲(chǔ)存液，避光并在-20 ℃保存。

2.3 分組及藥物干預(yù)

將大鼠隨機(jī)分為4組：A組為假手術(shù)組;B組行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)組;C組為行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)并注射雌激素組，術(shù)后每只小鼠肌肉注射0.5 ml的雌激素;D組雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，術(shù)后肌內(nèi)注射自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）2 μl/只。

2.4 檢測(cè)項(xiàng)目

2.4.1 HE染色觀察 使用石蠟切片后脫蠟至水，用蘇木素染色液染色5 min，用水沖洗3次后使用95%乙醇分色5～10 s，使用伊紅染色液染色1 min繼續(xù)使用乙醇脫水后用二甲苯透明5 min后用中性樹(shù)膠封片;在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.4.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 按照Western blot檢測(cè)方法操作，使用蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對(duì)VEGFA、p-mTOR、Beclin-1、LC3、Caspase-3和Caspase-9蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。以目的蛋白條帶與β-actin灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS 20.0軟件和GraphPda Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析作圖，方差分析使用Analysis of variance，當(dāng)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步采用SNK方法進(jìn)行比較;使用單因素方差分析（ANOVA）時(shí)，檢驗(yàn)中P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異非常顯著，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 HE染色觀察大鼠椎間盤(pán)髓核變化

由圖1可以看出，control組大鼠髓核結(jié)構(gòu)完整，且囊泡結(jié)構(gòu)可完整可見(jiàn);model組和3-MA組大鼠髓核組織脫水嚴(yán)重，其結(jié)構(gòu)也被破壞，髓核退變明顯，相比model組3-MA組大鼠更為嚴(yán)重;相比model組，estrogen組大鼠髓核組織較為完整，無(wú)明顯被破壞和髓核退變出現(xiàn)。

3.2 大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-A及相關(guān)信號(hào)通路p-mTOR蛋白組間比較

由圖2可以看出，相比control組，model組和3-MA組大鼠VEGF-A和p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;相比model組，estrogen組大鼠VEGF-A和p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3.3 大鼠椎間盤(pán)組織的自噬水平組間比較

由圖3可以看出，相比control組，model組和3-MA組大鼠Beclin-1和LC-3蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;相比model組，estrogen組大鼠Beclin-1和LC-3蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），相比model組，3-MA大鼠Beclin-1有一定程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3.4 大鼠椎間盤(pán)組織凋亡情況組間比較

由圖4可以看出，相比control組，model組和3-MA組大鼠Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;相比model組，estrogen組大鼠Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

由圖5可以看出，control組大鼠椎間盤(pán)組織有較少的凋亡，相比control組，model組恒溫3-MA組大鼠椎間盤(pán)組織凋亡顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;相比model組，estrogen組大鼠椎間盤(pán)組織凋亡顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

4 討論

自噬可以在一定程度上保護(hù)椎間盤(pán)細(xì)胞，在正常椎間盤(pán)細(xì)胞中自噬可以持續(xù)激活并保證椎間盤(pán)細(xì)胞在低血供時(shí)的能量供應(yīng)[8]。正常程度的自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)損傷蛋白質(zhì)和失去功能的細(xì)胞并維持細(xì)胞的正常功能和活力。目前尚無(wú)公認(rèn)的可以完全模擬椎間盤(pán)退變的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型[9]，本實(shí)驗(yàn)使用物理方法制成腰椎不穩(wěn)定模型，后切除卵巢后會(huì)加速椎間盤(pán)的退變[10]，造成大鼠椎間盤(pán)退變模型。李世平等[11]研究表明，人和大鼠的正常關(guān)節(jié)軟骨中，自噬的標(biāo)志性基因Beclin-l和LC3有明顯表達(dá)。在嚴(yán)重退變的人和大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Beclin-l和LC3的表達(dá)顯著減少。同時(shí)王月霞等[12]研究表明，自噬活性的降低可能是導(dǎo)致受損大分子物質(zhì)的蓄積和細(xì)胞死亡，并最終引起關(guān)節(jié)和椎間盤(pán)退變。本實(shí)驗(yàn)中可以看出，相比假手術(shù)組，模型組大鼠體內(nèi)自噬相關(guān)標(biāo)志性基因Beclin-l和LC3有顯著降低，表明椎間盤(pán)退變的大鼠體內(nèi)自噬顯著降低，這和Zheng等[2]研究得出的結(jié)論相一致。

椎間盤(pán)退變涉及到的相關(guān)信號(hào)通路較多，間盤(pán)組織中VEGF表達(dá)增加，一定程度上激活了mTOR信號(hào)通路，抑制了細(xì)胞自噬水平，使得椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的加速發(fā)生。有研究表明，椎間盤(pán)退變過(guò)程與新生小血管密切相關(guān)，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，椎間盤(pán)退變患者的纖維環(huán)前外側(cè)部逐漸出現(xiàn)新生小動(dòng)脈血管。吳宥熹等在研究心機(jī)細(xì)胞缺血時(shí)發(fā)現(xiàn)VEGF可以通過(guò)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路抑制細(xì)胞的自噬。目前研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、代謝中發(fā)揮重要作用。人類和鼠類在mTOR結(jié)構(gòu)的氨基酸分子水平上的同源性高達(dá)95%，使用大鼠的mTOR研究人類的mTOR信號(hào)通路有很大的可信度。相關(guān)研究表明，mTOR不僅有控制基因翻譯、參與DNA/RA合成、影響蛋白質(zhì)降解等mTOR信號(hào)通路不僅是細(xì)胞正常生長(zhǎng)周期的調(diào)控中心，還是PI3K-AKT信號(hào)通路控制細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)。mTOR信號(hào)通路在大鼠椎間盤(pán)軟骨終板細(xì)胞體外自然退變過(guò)程中起到重要作用，軟骨終板細(xì)胞傳代過(guò)程中，mTOR信號(hào)通路主要負(fù)責(zé)加速、緩解甚至抑制大鼠椎間盤(pán)軟骨終板細(xì)胞的生理性退變。本研究中可以看出，相比模型組，假手術(shù)組大鼠體內(nèi)VEGF含量顯著升高，且相關(guān)信號(hào)通路蛋白p-mTOR顯著升高，說(shuō)明VEGF含量升高可以介導(dǎo)激活mTOR信號(hào)通路促進(jìn)mTOR磷酸化轉(zhuǎn)化為p-mTOR，促進(jìn)細(xì)胞的自噬，抑制椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡、緩解椎間盤(pán)退變。

研究表明，自噬可以一定程度保護(hù)細(xì)胞，適度自噬可保護(hù)細(xì)胞;但過(guò)度自噬也會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重的退變椎間盤(pán)患者體內(nèi)的自噬水平要明顯低于正常椎間盤(pán)，而凋亡水平卻顯著升高。目前凋亡與椎間盤(pán)退變的關(guān)系已有較多的研究，在VEGF的介導(dǎo)下，椎間盤(pán)細(xì)胞的死亡受體途經(jīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與線粒體凋亡途徑可以被激活，引起細(xì)胞凋亡。目前研究較多的控制凋亡的因子為Bcl-2家族和Caspase家族。Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子。相關(guān)研究通過(guò)前列腺腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析得出，Caspase-9基因處于Caspase家族激活基因的頂端，是Caspase家族中最常見(jiàn)的凋亡啟動(dòng)子，通過(guò)自身的裂解使得 proCaspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3。這種有活性的Caspase-3是執(zhí)行凋亡的基因，主要作用機(jī)理是通過(guò)剪切另外的Caspase底物引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究中可以看出，相比假手術(shù)組，模型組大鼠體內(nèi)的Caspase-3、Caspase-9含量顯著升高，說(shuō)明模型組大鼠體內(nèi)細(xì)胞凋亡程度增加、自噬程度降低，使用雌激素抑制大鼠椎間盤(pán)退變組大鼠體內(nèi)Caspase-3、Caspase-9含量顯著降低說(shuō)明該組大鼠體內(nèi)細(xì)胞凋亡顯著降低，細(xì)胞自噬顯著升高，相關(guān)凋亡信號(hào)通路得到了促進(jìn)。

綜上所述，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)自噬相關(guān)通路在椎間盤(pán)退變大鼠中作用，其作用機(jī)制可能促進(jìn)mTOR信號(hào)通路、降低細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)。VEGF的升高可以使得p-mTOR、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著降低、Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)顯著升高。但血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)自噬相關(guān)通路相對(duì)較復(fù)雜，然而本研究的自噬信號(hào)通路較少，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以研究VEGF介導(dǎo)其他信號(hào)通路對(duì)椎間盤(pán)退變的保護(hù)機(jī)制。

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（收稿日期：2018-12-20）