鐘志輝　白國(guó)昌

[摘要] 目的 探討高遷移率族蛋白1（HMGB1）在骨肉瘤組織的表達(dá)情況及其與臨床病理因素之間的關(guān)系，并探討可能機(jī)制。 方法 方便選取2012年1月—2016年12月53例確診為原發(fā)性骨肉瘤患者作為實(shí)驗(yàn)組，同期確診為骨軟骨瘤30例患者作為對(duì)照組，采用免疫組化檢測(cè)HMGB1蛋白的表達(dá)情況。在實(shí)驗(yàn)組分析HMGB1的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系，并探討其與Ki-67的表達(dá)關(guān)系。 結(jié)果 骨肉瘤組織中HMGB1蛋白表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，有54.7%病例為高表達(dá)，其比率高于骨軟骨瘤病例（23.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）。HMGB1的高表達(dá)與較高級(jí)的Enneking分期（P=0.011）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.003）有關(guān)。相比之下，HMGB1的表達(dá)與其他臨床因素（包括性別、年齡、解剖位置、原發(fā)腫瘤大小和組織學(xué)類型）之間沒有顯著相關(guān)性（P>0.05）。并且HMGB1蛋白的表達(dá)與Ki-67蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)關(guān)系（γ=0.632，P<0.05）。 結(jié)論 HMGB1在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，有望成為骨肉瘤診斷及治療的分子靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 骨肉瘤;HMGB1; Ki-67;免疫組化

[中圖分類號(hào)] R684? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-0742（2019）05（a）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of high mobility group protein 1 （HMGB1） in osteosarcoma and its relationship with clinicopathological factors and possible mechanism. Methods From January 2012 to December 2016， a total of 53 patients with primary osteosarcoma were convenient selected as the experimental group while 30 patients with osteochondroma were selected as the control group. The expression of HMGB1 protein was detected by immunohistochemistry. In the experimental group， the relationship between HMGB1 expression and clinicopathological factors was analyzed. Moreover， the relationship between HMGB1 expression and Ki-67 expression was also explored. Results Expression of HMGB1 protein was detected both in the nucleus and cytoplasm of osteosarcoma cell. The expression of HMGB1 in osteosarcoma was higher than that in osteochondroma （54.7% vs 23.3%， P=0.006）. The high expression of HMGB1 was associated with the high Enneking stage （P=0.011） and distant metastasis （P=0.003）. In contrast， there was no significant correlation between HMGB1 expression and other clinicopathological factors， including gender， age， anatomical location， size of primary tumors and histological type （P>0.05）. The expression of HMGB1 protein was positively correlated with the expression of Ki-67 protein （γ= 0.632， P<0.05）. Conclusion HMGB1 plays an important role in the occurrence and development of osteosarcoma and is expected to become a molecular target for diagnosis and treatment of osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma; HMGB1; Ki-67; Immunohistochemistry

骨肉瘤作為最常見的惡性、原發(fā)性骨腫瘤之一，是兒童和青少年癌癥相關(guān)死亡的第二原因[1]。它被認(rèn)為是起源于與骨形成相關(guān)的原始間充質(zhì)細(xì)胞，通常位于長(zhǎng)骨干骺端，尤其是脛骨近端和股骨遠(yuǎn)端[2]。盡管新輔助化療和手術(shù)切除技術(shù)有了很大改進(jìn)，骨肉瘤的總生存率在過去幾十年中沒有顯著變化。更糟的是，有局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率低于30%[3]。雖然一些基因的突變被認(rèn)為與骨肉瘤有關(guān)，但其發(fā)病的分子機(jī)制仍不清楚[4]。因此，尋找新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，尋找潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)提高骨肉瘤患者的預(yù)后具有重要意義。

高遷移率族蛋白-l （High-mobility group protein B1，HMGB1） 是一種廣泛存在于真核生物的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有很高的遷移率而得名[5]。新近研究發(fā)現(xiàn)HMGBl在多種類型腫瘤的表達(dá)水平均顯著高于相應(yīng)的正常組織，如乳腺癌、前列腺癌、胃腸道腺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等，且大多與臨床預(yù)后相關(guān)[6-8]。但HMGB1與骨肉瘤的關(guān)系相關(guān)研究仍鮮有報(bào)道。因此，該研究方便選取2012年1月—2016年12月53例原發(fā)性骨肉瘤患者，檢測(cè)骨肉瘤組織中HMGB1的表達(dá)，并探討HMGB1的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系及可能的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便選取福建醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和漳州市醫(yī)院骨科53例原發(fā)性骨肉瘤患者。所有骨肉瘤均未經(jīng)任何處理收集。將初始活檢組織標(biāo)本凍存于液氮中直至使用。在確診后，所有患者根據(jù)Enneking分期系統(tǒng)進(jìn)行術(shù)前新輔助化療和手術(shù)切除[9]。出院后定期隨訪。從醫(yī)院病歷中獲取腫瘤部位、局部、遠(yuǎn)處狀態(tài)和總生存率等相關(guān)臨床資料。選取同期確診為骨軟骨瘤30例患者作為對(duì)照。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有入選患者均簽署知情同意書。

1.2? 主要實(shí)驗(yàn)試劑

HMGB1單克隆抗體、Ki67 單克隆抗體抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。抗原修復(fù)液、PV-9000試劑及二氨基聯(lián)苯（DAB）顯色試劑盒等購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3? 免疫組化方法

骨肉瘤及骨軟骨瘤組織以蠟塊形式儲(chǔ)存，實(shí)驗(yàn)時(shí)取出，切成4μm厚切片貼附于載玻片，置60℃烤箱中過夜。依次置于二甲苯、無水酒精中、95%酒精中、80%酒精、70%酒精中進(jìn)行脫蠟和再水合。使用檸檬酸鹽緩沖液（10 mM，pH 6）在微波爐中進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原回收。使用正常山羊血清抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再將載玻片與3%過氧化氫溶液在甲醇中孵育。隨即在切片上加入抗HMGB1（Abcam，美國(guó)）或Ki-67（Abcam，美國(guó)）小鼠單克隆抗體，在4℃孵育過夜。然后用過氧化物酶抗小鼠血清免疫球蛋白G（ZSGB-BIO，中國(guó)）孵育切片。洗滌后，用DAB顯色試劑盒檢測(cè)HMGB1。再用蘇木精對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染色。最后，在一系列的酒精稀釋和二甲苯中脫水切片。

1.4? 觀察指標(biāo)

為了評(píng)價(jià)目標(biāo)蛋白的染色結(jié)果，每張切片均由2名病理科醫(yī)生獨(dú)立雙盲觀察。隨機(jī)選取具有代表性的10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)約200個(gè)細(xì)胞。根據(jù)染色細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。染色細(xì)胞百分率分級(jí)評(píng)分：染色細(xì)胞<5%為0分， 6%～25%為1分，26%～ 50%為2分，>51%為3分;染色強(qiáng)度分級(jí)評(píng)分：基本不著色為0分，淺著色為1分，適中著色為2分，深著色為3分。將每張切片染色細(xì)胞百分率得分與染色強(qiáng)度得分相加為最終得分：0～3分為低表達(dá)，超過3分為高表達(dá)。

1.5? 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示，計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料[n（%）]用χ2檢驗(yàn)，兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? HMGB1在骨肉瘤及骨軟骨瘤組織中的表達(dá)

為評(píng)估HMGB1在骨肉瘤中的表達(dá)，對(duì)53例骨肉瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示骨肉瘤組有29個(gè)樣本（54.7%）中檢測(cè)到HMGB1高表達(dá)，細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均可見。而在骨軟骨瘤組30個(gè)樣本僅有7樣本（23.3%）檢測(cè)到HMGB1高表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2? HMGB1表達(dá)與骨肉瘤臨床病理因素的關(guān)系

為探討HMGB1表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系，將53例原發(fā)性骨肉瘤患者分為兩組。結(jié)果顯示HMGB1的高表達(dá)與較高級(jí)的Enneking分期（P=0.011）、和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P=0.003）。相比之下，HMGB1的表達(dá)與其他臨床因素（包括性別、年齡、解剖位置、原發(fā)腫瘤大小和組織學(xué)類型）之間沒有顯著相關(guān)性，見表2。

2.3? HMGB1表達(dá)與Ki-67的相關(guān)性

HMGB1 蛋白高表達(dá)的病例中， Ki-67蛋白高表達(dá)率為75.9% （22/29）， HMGB1 低表達(dá)的病例中， Ki-67的高表達(dá)率為12.5% （3/24）。結(jié)果表明HMGB1蛋白的表達(dá)與Ki-67蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)關(guān)系（γ=0.632，P=0.002），見表3。

3? 討論

骨肉瘤是嚴(yán)重威脅青少年健康的一種惡性腫瘤。盡管近年來新輔助化療和切除重建方面有了明顯的進(jìn)展，但骨肉瘤總的生存率沒有實(shí)質(zhì)性的改變。因此，尋找能夠準(zhǔn)確的診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物，從而進(jìn)行骨肉瘤的精準(zhǔn)治療，以改善治療效果顯得尤為重要[10]。

該研究初步進(jìn)行了HMGB1在骨肉瘤中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系研究。免疫組化的結(jié)果表明，HMGB1蛋白在超過一半的骨肉瘤患者組織中高表達(dá)，而骨軟骨瘤這一良性骨病變組織中僅有23.3%的高表達(dá)率，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）。He等人[11]研究也發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞HMGB1高表達(dá)率達(dá)51.7%，與該研究接近。這提示HMGB1可能是骨肉瘤診斷的重要分子。近年來，Wu等[12]發(fā)現(xiàn)90例肺癌組織HMGB1高表達(dá)例數(shù)為51例（56.7%），而在臨近正常組織中僅有30.0%高表達(dá);Rrapaj等[13]發(fā)現(xiàn)HMGB1在惡性胸膜間皮瘤中也高表達(dá)。Kostova 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在食管癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)率增高，并且在中度分化的癌中HMGB1蛋白的定位是細(xì)胞核周圍的，而在低分化的癌中有非特異性核聚集的趨勢(shì)。這與該研究結(jié)果相近，即HMGB1蛋白可同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。大量研究表明HMGB1在許多惡性腫瘤組織中有不同程度的高表達(dá)提示HMGB1可能參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程。

進(jìn)一步行臨床病理因素與HMGB1相互關(guān)系研究，結(jié)果表明HMGB1表達(dá)增加與重要的臨床病理因素有關(guān)，包括Enneking分期（P=0.011）、和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.003）。盡管這兩種因素通常與骨肉瘤較差的預(yù)后有關(guān)。但臨床病理因素是病人就診時(shí)不能改變的事實(shí)，其只能幫助判斷而不是改變預(yù)后。然而，HMGB1與不良的臨床病理因素相關(guān)，則提示其有可能成為潛在治療靶點(diǎn)，有助于開發(fā)新藥以改善骨肉瘤患者預(yù)后。盡管該研究提示HMGB1與原發(fā)骨肉瘤大小無關(guān)，但有研究提示HMGB1與腫瘤大小和核分級(jí)相關(guān)，并且HMGB1高表達(dá)直接導(dǎo)致骨肉瘤生存率下降[11]。這種差異一方面可能歸因于所采納的標(biāo)準(zhǔn)不一樣，有的研究以腫瘤直徑7 cm來分組，而該研究則以常用的5 cm來分組;另一方面可能是納入的病例數(shù)存在抽樣誤差。此外，有研究提示HMGB1卻可能是某些惡性腫瘤，如胰腺癌進(jìn)展的抑制因素，因?yàn)镠MGB1能抑制K-Ras基因驅(qū)動(dòng)的腫瘤進(jìn)程[15]。這表明HMGB1所發(fā)揮的作用可能與腫瘤類型相關(guān)。

HMGB1影響惡性腫瘤的進(jìn)展機(jī)制目前尚未被完全闡明。Ki-67是一種細(xì)胞核蛋白，除靜止期以外的所有細(xì)胞周期中均有表達(dá)，故其被當(dāng)做大多腫瘤組織細(xì)胞增殖活性的標(biāo)記物。許多研究提示 Ki-67 的表達(dá)與骨肉瘤的惡性程度及預(yù)后等因素密切相關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)53例骨肉瘤患者中有25例Ki-67高表達(dá)，且其中22例一并有HMGB1高表達(dá)，兩者之間呈明顯的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.632，提示HMGB1可能通過促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖來促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，因此與不良的臨床病理因素關(guān)聯(lián)。有學(xué)者則認(rèn)為HMGB1通過增加腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或增加血管形成來促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展[16];或者HMGB1通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展[8];也有研究表明HMGB1與乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性相關(guān)[17]。該課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ki-67與骨肉瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133表達(dá)正相關(guān)，而且兩者結(jié)合更能判定其預(yù)后[18]。那么HMGB1與骨肉瘤的干細(xì)胞特性是否相關(guān)值得進(jìn)一步研究。此外，HMGB1影響骨肉瘤進(jìn)展的其它機(jī)制仍尚不完全清楚，需要進(jìn)一步研究。該研究還有其他局限性，如該研究屬于回顧性研究可能會(huì)導(dǎo)致信息收集的偏倚，樣本量不夠大。因此，將在未來進(jìn)行更大規(guī)模和更具前瞻性的研究。

綜上所述，該研究初步表明HMGB1的高表達(dá)與骨肉瘤的侵襲性臨床病理特征相關(guān)。因此，HMGB1在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，有望成為骨肉瘤潛在的診斷與預(yù)后生物標(biāo)志物，以及有前途的骨肉瘤分子治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-01-29）