譚文敏 賴庭文 韓鋒

目前，臨床針對CHC患者可采用直接抗病毒(DAA)治療，控制病情進(jìn)展。然而，部分患者對治療不應(yīng)答，停藥后復(fù)發(fā)問題尚未得到解決[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-28B(IL-28B)基因多態(tài)性可能與抗病毒治療療效存在關(guān)聯(lián)，但有待進(jìn)一步證實(shí)[2]。本研究主要分析了外周血IL-28B基因多態(tài)性對DAA治療CHC患者療效的預(yù)測價(jià)值，以為臨床治療提供依據(jù)，提高治療效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2014年1月—2017年1月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的CHC患者169例，男97例，女72例；年齡22～55歲，平均年齡為(31.29±8.64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)參考《中國丙型病毒性肝炎醫(yī)院感染防控指南》[3]診斷：伴有尿黃眼黃、食欲減退、惡心、乏力等表現(xiàn)；(2)血清HCV RNA呈陽性；(3)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)增高；(4)經(jīng)MRI、CT等檢查提示無肝硬化表現(xiàn)。體質(zhì)指數(shù)為18～26 kg/m2，平均為(22.64±2.18)kg/m2；血清HCV RNA為≤4×105拷貝/毫升者90例，>4×105拷貝/毫升79例；有飲酒史者31例，有吸煙史者27例，有脂肪肝者16例，有高血壓病者43例；HCV基因型為Ib型者150例，非Ib型19例。納入患者入院前未進(jìn)行過抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠、哺乳期婦女；(2)惡性腫瘤；(3)自身免疫性疾病；(4)既往有吸毒史；(5)合并存在甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥。患者給出書面知情同意書，本研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過。

二、治療方法

DAA方案：給予索非布韋(吉利德)400 mg口服，1次/d，達(dá)拉他韋(AstraZeneca Pharmaceuticals LP)60 mg口服，1次/d，共治療24周。

三、療效評定

在治療24周后入院復(fù)查，評價(jià)療效。參考《中國丙型病毒性肝炎醫(yī)院感染防控指南》[3]評估：(1)快速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)：療程滿4周后，未測到HCV RNA；早期應(yīng)答(EVR)：療程滿12周后，HCV RNA下降≥2個(gè)對數(shù)級，或<最低檢測限；持續(xù)應(yīng)答(SVR)：療程滿24周后，HCV RNA<最低檢測限；無應(yīng)答(NR)：未滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。

四、IL-28B基因多態(tài)性測定

儀器包括PCR擴(kuò)增儀(美國ABI PCR 9700)、熒光定量PCR儀(美國ABI 7000)、離心機(jī)(德國Sigma 3-18K)、凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能 GIS-2010)、電泳儀(北京六一 DYY-Ⅲ8)、分光光度計(jì)(Eppendorf BioPhotometer)。首先根據(jù)DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作提取DNA：具體如下：①搗碎凝血塊，取100 μL放置在離心管內(nèi)，取800 μL溶血試劑，離心5 min(8 000 rpm)，分離血清；②取溶血試劑800 μL加入，離心5 min(8 000 rpm)，分離血清，搗碎；③于60℃環(huán)境下水浴；④加飽和酚500 μL，離心5 min(12 000 rpm)；⑤對上層水相進(jìn)行吸取，置于離心管內(nèi)，加氯仿300 μL，離心10 min(12 000 rpm)；⑥分離上層清液，置于離心管內(nèi)，再次加氯仿、離心；⑦分離血清，加NaAC，加異丙醇，沉淀20 min，溫度為-20℃；⑧離心10 min(12 000 rpm)，分離血清；⑨若溶解不充分，則水浴30 min，溫度為55℃；⑩對DNA純度進(jìn)行測定，獲得電泳結(jié)果。獲得DNA后，經(jīng)PCR擴(kuò)增儀對其進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)空白對照(3個(gè))，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，(95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán))，72℃ 10 min。經(jīng)配套軟件對熒光信號(hào)進(jìn)行讀取，分析等位基因類型。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

經(jīng)SPSS 20.0軟件分析對臨床資料進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，利用logistic回歸模型分析IL-28B基因多態(tài)性是否為CHC患者抗病毒療效的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、169例CHC患者預(yù)后與IL-28B基因多態(tài)性的關(guān)系

在169例CHC患者中，有135例存在病毒學(xué)應(yīng)答，占79.88%，34例無應(yīng)答，占20.12%。在有應(yīng)答組中，rs8099917TT、rs12979860CC占比分別為89.63%、88.15%，顯著高于無應(yīng)答組的44.12%、47.06%(P<0.05)，見表1。

表1 CHC患者預(yù)后與IL-28B基因多態(tài)性的關(guān)系[n(%)]

二、CHC患者預(yù)后與臨床特征的關(guān)系 有應(yīng)答組無脂肪肝、Child肝功能A級、rs8099917 TT、rs12979860CC占比分別為94.81%、40.00%、89.63%、88.15%，顯著高于無應(yīng)答組的73.53%、26.47%、44.12%、47.06%(P<0.05)，見表2。

表2 CHC患者預(yù)后與臨床特征的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表2

注：*采用連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)

三、CHC患者預(yù)后的影響因素分析

利用logistic回歸模型對各變量進(jìn)行量化賦值，見表3，根據(jù)表2將脂肪肝、Child肝功能分級、rs8099917、rs12979860納入模型，結(jié)果提示脂肪肝、Child肝功能C級、rs8099917TG、rs12979860CT是患者抗病毒治療無病毒學(xué)應(yīng)答的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表3 量化賦值表

表4 CHC患者預(yù)后的影響因素分析

討 論

CHC是臨床常見的肝病，目前，臨床針對病毒性肝炎患者主要采用抗病毒治療，部分患者經(jīng)治療后能取得較理想的效果，然而，部分病例效果欠佳。研究表明約50%～80%的CHC病例經(jīng)治療后能獲得病毒學(xué)應(yīng)答[4]。本研究結(jié)果提示在169例患者中，有135例經(jīng)DAA治療后存在病毒學(xué)應(yīng)答，應(yīng)答率為79.88%，與上述研究結(jié)論基本符合。

本研究發(fā)現(xiàn)IL-28B的rs8099917TG、rs12979860CT位點(diǎn)基因?qū)共《警熜в绊戄^大，其中rs8099917TT、rs12979860CC獲得應(yīng)答的幾率更高，而rs8099917TG、rs12979860CT獲得應(yīng)答的幾率相對較小。IL-28B基因在19號(hào)染色體上編碼為IFN-λ3，即便含量較低，也能對病毒感染誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。既往有研究發(fā)現(xiàn)IL-28B危險(xiǎn)等位基因可下調(diào)IFN-λ水平，并導(dǎo)致細(xì)胞因子功能削弱，降低機(jī)體抗病毒應(yīng)答能力，這提示IL-28B基因可能與病毒感染疾病進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)[5]。另有研究指出要想明確IL-28B基因與丙型肝炎的關(guān)系，必須先明確IFN-λ與丙型肝炎的關(guān)系[6]。IFN-λ主要通過病毒誘導(dǎo)生成，它與受體相結(jié)合，能將Jak-Stat信號(hào)途徑激活，并激活I(lǐng)SGF3轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，達(dá)到抗病毒目的。肝細(xì)胞、上皮組織中均含IFN-λ受體，它有抗病毒作用。國外研究發(fā)現(xiàn)在IL-28B的rs8099917位點(diǎn)基因中，TT屬于保護(hù)性基因，攜帶此基因的患者更易獲得SVR，且IL-28B多態(tài)性對IFN-λ表達(dá)水平有明顯影響[7]。本研究結(jié)果也提示攜帶rs8099917 TT基因的患者病毒學(xué)應(yīng)答率更高，與上述研究結(jié)論基本符合。這可能的機(jī)制在于攜帶IL-28B優(yōu)勢基因的患者干擾素刺激基因(ISG)表達(dá)較低，其在外源性IFN-α影響下可增強(qiáng)IL-28B誘導(dǎo)作用，提高ISG表達(dá)水平，有利于獲得SVR。

本研究還發(fā)現(xiàn)IL-28B的rs12979860 CC基因也是CHC患者抗病毒治療療效的保護(hù)性基因。有學(xué)者以HCV感染者為研究對象，發(fā)現(xiàn)rs12979860 CC基因占比高達(dá)93.4%，CT型占比僅6.6%，在CC型基因中，超過70%的患者經(jīng)治療后能獲得SVR[9]，與本研究結(jié)論基本符合。本研究經(jīng)logistic回歸模型證實(shí)CHC患者DAA療效的影響因素包括脂肪肝、Child肝功能C級、rs8099917TG、rs12979860CT。其中脂肪肝、肝功能分級已被相關(guān)研究[10]證實(shí)為CHC患者DAA療效的影響因素，本研究創(chuàng)新點(diǎn)在于證實(shí)rs8099917TG、rs12979860CT也對DAA療效有影響，能為該病治療提供依據(jù)。在CHC患者未來的治療中，臨床可根據(jù)IL-28B基因多態(tài)性進(jìn)行干預(yù)，若患者具備優(yōu)勢基因型，則可給予常規(guī)抗病毒治療，或縮短服藥時(shí)間，降低不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。若患者無優(yōu)勢基因型，可根據(jù)情況選擇小分子靶向抗病毒治療，改善預(yù)后。

綜上，CHC患者DAA療效與IL-28B的rs8099917TG、rs12979860CT位點(diǎn)基因表達(dá)有關(guān)，臨床可將其作為預(yù)測療效的重要指標(biāo)。本研究因受研究時(shí)間、研究經(jīng)費(fèi)的限制，僅納入169例患者為研究對象，未來將擴(kuò)大樣本量對此進(jìn)行大樣本、多中心的研究。